临床医学论文-脑胶质瘤特异抗原肽白介素-13α2受体重组表达质粒的构建.doc

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1、临床论文胶质瘤特异性抗原肽白细胞介素132受体重组表达质粒的构建摘要目的:构建白细胞介素132受体(IL-重组表达质粒，为检测IL-132抗原肽的表达奠定实验基础。

2、方法:用RT-PCR方法从U251胶质瘤细胞系中获得IL-13R2的目的基因，然后将其与克隆质粒pMD19SimpleT载体连接，转入DH5株进行克隆。

3、用Xho和Hind从克隆质粒上切下目的基因，同样双酶切后连接到表达质粒pET-28a上，再转入BL21(DE菌株。

提取重组质粒进行酶切和测序鉴定。

4、结果:目的基因IL-13R2与表达质粒pET-28a连接，成功构建重组质粒pET-28a-IL-13R2。

5、结论:通过RT-PCR可获得IL-13R2的目的基因，并成功与表达质粒连接，构建了pET-28a-IL-13R2重组质粒，为检测IL-13R2抗原肽的表达并用于胶质瘤的免疫治疗提供了良好的实验和理论基础。

6、【关键词】胶质瘤白细胞介素-13受体质粒摘要:目的:构建有助于IL-13表达的重组表达质粒pet-28a-IL-13r2。

13R2抗原。

7、方法:用RT-PCR方法从U251胶质瘤细胞株中获得目的基因IL-13R2，然后连接到克隆质粒pMD19SimpleT载体上，转入DH5。

8、使用XhoI和HindIII消化来自重组克隆质粒的IL-13R2，然后连接至使用相同酶消化的表达质粒pET-28a，并转化至BL21(DE。

最后提取重组质粒，用PCR酶切和测序鉴定。

结果:成功构建了重组表达质粒pET-28a-IL-13R2。

结论:利用RT-PCR技术可以从U251胶质瘤细胞系中获得目的基因IL-13R2，并成功连接到表达质粒pET-28a上。

pET-28a-IL-13R2的构建不仅对IL-13R2抗原的表达，而且对胶质瘤的免疫治疗都有很大的贡献。

关键词:胶质瘤；白介素-13；受体；表达质粒近年来，随着对分子生物学和免疫治疗认识的不断提高，胶质瘤的免疫治疗越来越受到重视。

作为胶质瘤的特异性抗原肽，IL-13R2可以呈递来自树突状细胞的抗原信息，激活细胞毒性T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞1，2本研究旨在构建IL-13R2的表达质粒，为今后进一步检测IL-13R2抗原肽的表达和免疫治疗研究奠定实验基础。

材料和方法1主要试剂和细胞株Trizol试剂(购自美国Invitrogen公司)、Fermentas第一链cDNA合成试剂盒(购自公司)、U251胶质瘤细胞株(购自中国科学院上海生物细胞研究所)、高糖培养基(购自上海)、ExTaq酶、Hind内切酶、XhoI内切酶、DNA连接酶、X-Gal、pMD19SimpleT载体、DH5菌(均购自大连宝生物公司)、凝胶回收试剂盒、质粒2主要仪器:细胞培养箱(HARRISUSA)、洁净工作台(TelstarBio-AII-A)、倒置显微镜(徕卡DMIL)、PCR仪(ThermoHgbaid)、高速离心机(称翔翼TDZ5-WS)、全温振荡器(HZQ-FX)、凝胶成像仪(BioSensSC、电热恒温水浴、du800核酸/蛋白质分析仪3方法1U251胶质瘤细胞培养:将胶质瘤细胞接种于含高糖DMEM培养基(含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素)的六孔培养板中，5%CO2培养，每3天传代1次。

2RT-PCR获得IL-13R2目的基因:Trizol从培养的胶质瘤细胞中一步提取总RNA，用Fermentas逆转录起始链cDNA合成试剂盒逆转录成cDNA，以cDNA为模板用ExTaq酶PCR扩增获得目的基因。

根据Genbank中的IL-13R2(登录号NM_000的全序列设计PCR引物。

引物为上游:5-ggcctccgagatgcttttttttttttgctt-3，和下游:5-gcgagctttttttttttttttttttttc-3。

XhoI和HindIII的切割点分别为，前三个为保护碱基。

PCR反应条件为:94预变性5min，94变性30s，59退火45s，72延伸1min，35个循环。

最后，72保温5min。

3感受态细胞的制备:选取DH5和BL21甘油菌各1l，在5mlLB培养基中220r/min摇床过夜，次日100切换，再摇床3小时。

将5ml菌液预冷一段时间，然后置于EP管中，在4000r/min离心10min收集细菌。

弃去上清液后，用75ml预冷的1mmol/L氯化钙溶液悬浮细胞，置于冰浴中30min，然后在4和4000r/min下离心10min收集细菌。

弃去上清液后，使用50L1mmol/L氯化钙溶液，用冰冷却。

4克隆质粒的构建:凝胶回收纯化后，将IL-13R2基因与pMD-19简单T载体在16下连接1小时，将100ldh5感受态细菌加入到整个连接液中，然后在42下加热45秒，然后置于冰中1min，加入890lSOC培养基，在37下220r/min摇匀。

最后，将其涂布于含有100g/ml氨苄青霉素、24g/mlIPTG和20mg/mlX-Gal的LB固体培养基中，37培养过夜。

第二天筛选蓝白斑，挑取白色单阳性菌落进行PCR、酶切和测序鉴定。

5表达质粒的构建:用Xho和hind从克隆质粒上切下目的基因，表达质粒pET-28a在37双酶切3h，回收凝胶并纯化。

16下，将IL-13R2的目的基因与表达质粒体外连接过夜，转化感受态菌株BL21(DE，铺于含50g/ml卡那霉素的LB固体培养基上，37培养过夜，次日挑取细菌进行PCR、酶切和测序鉴定。

结果1U251胶质瘤细胞形态学观察培养第二天后，胶质瘤细胞贴壁生长，胞体较大，呈多形性，有多个突起。

第三天后，细胞密度显著增加，细胞体变成纤维状(见图。

2IL-13R2目的基因的获得:RT-PCR成功获得IL-13r2目的基因，取5LPCR产物进行5%琼脂糖凝胶电泳80mv45min，紫外灯下1142bp处有一条明亮的目的条带，与理论值一致，如图2所示。

同时回收并纯化PCR产物凝胶，然后测序。

与Genbank中IL-13R2的全序列(登录号NM_000比较，同源性为100%。

3克隆质粒的构建将IL-13R2目的基因与pMD-19简单T载体连接后转化DH5细菌，发现LB固体培养基中生长约40个单个菌落(包括白色和蓝色菌落)，挑出白色转化体。

如图3所示，摇动质粒，经PCR、双酶切和测序鉴定，证明克隆质粒构建成功。

4表达质粒的构建用Xho和hind从克隆质粒上切下IL-13R2，然后与同样用双酶切下的表达质粒pET-28a连接，并转化到BL21(DE中。

在LB培养基上生长约20个单菌落后，挑取一个单菌落，摇床提取质粒，经PCR、双酶切和测序鉴定证明克隆质粒构建成功。

如图4所示，为酶切鉴定结果。

讨论胶质瘤是脑内最具破坏性的恶性肿瘤之一。

尽管近年来显微手术、放疗和化疗取得了很大进展，但胶质瘤患者的预后仍不容乐观。

免疫治疗具有高选择性和长期免疫记忆的优点，而树突状细胞(DC)作为最强的专职抗原提呈细胞，在抗肿瘤免疫的启动抗原提呈中发挥着强大的作用，因此用DC疫苗对胶质瘤进行免疫治疗越来越受到重视1，2然而，多年来，胶质瘤免疫治疗的抗原肽主要是肿瘤细胞裂解液和总RNA，由于其中包含许多已知和未知的抗原肽，容易发生自身免疫性疾病3，4因此，研究一种高靶向性、无自身免疫性疾病、易于生产和运输的胶质瘤特异性抗原肽是非常必要的。

我们的实验主要构建了胶质瘤特异性抗原肽的重组表达质粒，为今后胶质瘤的免疫治疗做了充分的准备。

研究表明，白细胞介素13受体2(IL-13R与人脑胶质瘤的发生发展密切相关。

作为诱饵受体，当与IL-13结合时，IL-13依赖的JAK-STAT信号通路不能被启动，但同时能激活该信号通路的IL-4R和IL被抑制。

同时Kawakami6和Joshi等7采用RT-PCR和免疫组织化学方法检测IL-13R2在胶质瘤中的表达。

结果显示，IL-13R2在高级别胶质瘤中高表达，在低级别胶质瘤中低表达或不表达，在正常脑组织中不表达。

但我们前期的基础研究，如RT-PCR、免疫组织化学等，也表明IL-13R2在胶质瘤表面有特异性表达，且与胶质瘤分级呈正相关8，因此我们可以将IL-13R2作为胶质瘤免疫治疗的特异性靶点。

近年来，Okano等9研究表明，负载IL-13R2抗原肽的树突状细胞可以激活HLA-A0201+限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，从而杀伤靶细胞。

Eguchi等人10也通过实验证明，IL-13R2抗原肽与树突状细胞结合后，可向T淋巴细胞呈递抗原信息，在共刺激分子B7的作用下，激活受HLA-A0201+限制的CD8+T细胞，最终启动细胞免疫介导的CTL反应和特异性-干扰素反应，杀伤肿瘤细胞。

我们的实验表明，根据Genbank设计的限制性内切酶引物，通过RT-PCR可以从高表达IL-13R2的U251胶质瘤细胞中获得IL-13R2的靶基因。

凝胶回收纯化后，通过T-A连接，可在体外与克隆质粒pMD-19简单T载体高效连接。

将连接产物克隆到DH5细菌中进行大量克隆和扩增，在LB固体培养基中培养过夜后，筛选蓝白斑，挑取白色重组体，摇匀细菌，提取重组质粒。

然后，用Xho和Hind限制性内切酶(这两种酶的酶切位点已设计在引物上)从重组克隆质粒上切下IL-13R2的目的基因，并通过双酶切纯化和回收。

在T4DNA连接酶的作用下，经相同双酶切后，与表达质粒pET-28a体外连接，构建重组表达质粒pET-28a-il-13r2，经PCR、酶切和测序鉴定。

利用原核表达载体构建表达质粒。

技术方法成熟，简单易行，以pet-28a为表达质粒。

因为它有六个组氨酸标签，所以可以用于将来的原核表达和纯化。

我们的实验研究表明，通过分子生物学方法在体外成功构建了重组表达质粒pET-28a-IL-13R2，并经PCR、酶切和测序证实，不仅为今后IL-13R2抗原肽的表达奠定了坚实的实验基础，也为今后用IL-13R2抗原肽进行胶质瘤的单抗原免疫治疗提供了良好的理论基础。

1俞建生，刘刚，应宏，等.恶性胶质瘤患者接种瘤苗抗原特异性细胞毒性T细胞的实验研究J.癌症研究，20XX，64(:4973-4979。

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孟庆海，博，等.树突状细胞疫苗治疗大鼠脑胶质瘤的实验研究J.中国神经外科杂志，20XX，22(:55-57。

4詹，佟颖，周永清J.中国神经外科杂志，20XX，19(:99-102。

5KawakamiM，TaguchiJ，MuratT，等.白细胞介素-13受体2链:结合和内化的必需成分，但不是白细胞介素-13诱导的信号转导途径的必需成分J.血液，20XX，97(:2673-2679。

6KawakamiM，KawakamiK，TakahashiS，等.人儿童脑肿瘤中白细胞介素-13受体2的表达分析J.癌症，20XX，101(:1036-1042。

7JoshiBH，PlautzGE，PuriRK。

白细胞介素-13受体链:人恶性胶质瘤原发组织中一种新的肿瘤相关跨膜蛋白J.中国肿瘤研究，20XX，60(:1168-8郑伟明，张建健，李建民，等.IL-13R2在星形细胞瘤中的表达及其与预后的关系J.中国神经外科杂志，20XX，22(:324。

等.人神经胶质瘤相关抗原白细胞介素13受体-2链中一种新的HLA-A*0201限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的鉴定J.临床癌症研究，20XX，8(:2851-2855。

10EguchiJ，HatanoM，NishimuraF，等.能够诱导改善的抗胶质瘤CTL应答的白介素-13受体A2肽类似物的鉴定J.癌症研究，20XX年，66(:5883-5891。