临床医学论文-脑胶质瘤细胞系对细小病毒MVM和H1易感性的研究.doc

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1、临床论文脑胶质瘤细胞系对细小病毒MVM和H1的敏感性研究摘要目的测定人脑胶质瘤细胞系AU87MG、UU373和小鼠脑胶质瘤细胞系GLMT539对细小病毒MVM和H1的敏感性，观察野生型病毒在肿瘤细胞中的繁殖情况。

2、方法体外培养肿瘤细胞，用不同剂量的MVM和H1病毒分别感染GLMT539和AU87MG、U138和U373细胞1小时，然后培养5天，每天计数活细胞。

3、噬斑形成试验用于确定病毒感染5天后(moi=细胞和细胞培养物上清液中的病毒总量结果与未感染细胞(对照组)相比，感染MOI2和MOI5病毒剂量的UU373和GL261细胞的活细胞数明显减少，U87细胞基本保持不变，A172和MT539细胞略有增加。

MOI=1的病毒剂量和对照之间没有差异。

4、噬斑形成试验结果显示，在MOI=1的病毒感染5天后，细胞和培养上清液中的U373和GL261的总病毒量略高于初始病毒量，而其他细胞的总病毒量低于初始病毒量。

结论不同胶质瘤对细小病毒的易感性不同。

5、UU373和GL261细胞对细小病毒H1或MVM敏感，其次是U87细胞，A172和MT539细胞不敏感。

U373和GL261细胞产生亚病毒的能力较弱。

6、【关键词】胶质瘤细小病毒对肿瘤治疗的敏感性胶质瘤细胞对野生型细小病毒MVM和H1摘要:目的评价人胶质瘤细胞系(AU87MG、UU和鼠胶质瘤细胞系(GL261和MT对野生型细小病毒HMVM的敏感性以及野生型病毒在这些肿瘤细胞中的复制能力。

7、方法将H1病毒和MVM病毒分别感染GLMTAU87MG、U138和U373细胞1小时，体外培养5天。

每天计算活细胞的数量。

8、在感染后第五天，通过噬斑试验(MOI=检测细胞和上清液中的病毒总量。

【结果】感染MOI2和MOI5后，与未感染细胞相比，UUGL261细胞数明显减少，U87MG无变化，A172和MT539细胞数略有增加。

MOI为1的剂量与对照组之间没有差异。

在感染后第五天测量的病毒总量低于或类似于大多数细胞系中的初始量。

与初始相比，U373和GL261样品显示病毒略有增加。

结论不同细胞系对感染的敏感性不同。

UU373和GL261在体外易受细小病毒感染；Umedium和AMT539不敏感。

U373和GL261产生子代病毒体的能力较弱。

关键词:胶质母细胞瘤；细小病毒；易感性；恶性胶质母细胞瘤是中枢神经系统中最常见的原发性肿瘤。

常规的治疗方法，如手术切除、放化疗等，远远不能满足治疗要求。

近年来，一些新的治疗策略显示出良好的前景，包括溶瘤病毒疗法。

细小病毒H1和MVM选择性杀伤肿瘤细胞和转化细胞，对正常细胞无影响，即“嗜瘤”和“溶瘤”，不整合入宿主染色体。

迄今为止，尚未发现它们对人类有致病性，其抗癌活性也已在各种肿瘤和转化细胞中得到证实，因此它们非常有希望成为一种新的抗肿瘤剂。

本文测定了几种胶质母细胞瘤细胞系对野生型MVM和H1的敏感性，并探讨了用细小病毒MVM和H1治疗胶质母细胞瘤的可能性。

材料和方法1材料细胞系:四种人脑胶质瘤细胞系AU87MG、U138和U373，两种小鼠脑胶质瘤细胞系GL261和MT539，指示细胞NBE-324K和A9由德国癌症研究中心提供。

MVM和H1病毒由德国癌症研究中心肿瘤病毒学实验室的Rommelaere博士提出。

其他试剂购自SIGMA公司。

2方法1细胞培养AU87MG、GL261和MT539细胞在含10%小牛血清、2mml-谷氨酸和抗生素的DMEM中培养，U138在含10%小牛血清、2mml-谷氨酸和抗生素的RPMI培养基中培养，U373在含10%小牛血清、2mml-谷氨酸和抗生素的MEM中培养。

培养条件为37，5%CO2和90%湿度。

2病毒易感性试验感染前一天，在6cm细胞培养皿中培养5105个细胞。

第二天，吸出培养液，加入用无血清MEM稀释的4ml病毒。

病毒剂量为MOI(感染复数)1，2，5。

每个剂量接种10个细胞板，并在5%CO2和90%湿度下孵育。

1小时后，吸出病毒，加入4ml含10%血清的培养基，培养5天。

每天取出两板细胞，台盼蓝染色计数。

3在蚀斑形成试验中，指示细胞NBE-324K感染了H1病毒，指示细胞A9感染了MVM病毒。

感染方法同上。

准备48预热的2%顶级琼脂和37预热的2MEM完全培养基(20%血清)，使用前按5的比例混合，感染1小时后吸出病毒，加入7ml琼脂和2MEM混合物，液体凝固后，放入细胞培养箱中培养5天。

第6天加入3ml中性红染色(染色液:37预热的2PBS45ml，48预热的2%琼脂45ml，中性红6ml，使用前混合)，12小时后计数菌斑。

4检测亚病毒的产生:培养4105个肿瘤细胞，用MOI=1的病毒感染1小时，吸出病毒，加入4ml培养基，培养5天。

收集细胞培养上清液，直接进行空斑试验，用胰蛋白酶消化细胞，加入细胞裂解物(50mMTris。

HCl，pH7，5mMEDTA)，在-8030min和3710min反复冻融3次，离心收集上清液，稀释后进行空斑试验。

每个样本的最终结果是通过将细胞及其培养上清液中的病毒数相加得到的。

2果实1对野生型细小病毒H1和MVM的易感性为了确定胶质瘤细胞是否可以用作细小病毒治疗的模型，我们测试了四种人胶质瘤细胞系AU87MG、U138和U373，以及两种小鼠胶质瘤细胞系GL261和MT539。

体外测试了这些细胞系对野生细小病毒H1和MVM的敏感性。

图1显示了不同病毒剂量下各细胞系的生长曲线。

可以看出，每种细胞系对病毒感染的易感性不同。

A172和MT539细胞生长减缓，U87细胞数量基本维持在初始水平，UU373和GL261细胞数量明显下降，感染后4天几乎全部死亡。

MOI=2和MOI=5的病毒剂量具有相似的效果。

MOI=1没有影响(AUMT或有轻微影响(UUGL结果表明，UU373和GL261细胞对细小病毒H1或MVM敏感，U87细胞次之，A172和MT539细胞不敏感。

2检测野生型病毒在肿瘤细胞中的繁殖。

用MOI=1的病毒感染肿瘤细胞5天后，用培养上清液和细胞裂解物进行噬斑形成实验。

结果显示，U373和GL261细胞和培养上清液中的病毒总量略大于初始病毒量。

AU87MG、U138和MT539的总病毒量略低于或等于初始病毒量。

在图2中，A是MOI=1的H1病毒感染NBE-324K细胞5d后的噬菌斑数目，B是MOI=1的MVM病毒感染A9细胞5d后的噬菌斑数目。

讨论细小病毒是一种小的(直径20nm)，无包膜的单链DNA病毒，基因约5000个核苷酸，可感染昆虫、鸟类和哺乳动物包括人类。

自主性细小病毒(俗称细小病毒)能在宿主细胞内自主复制，不整合到宿主染色体中，但病毒的复制依赖于宿主细胞的增殖和分化1支原体和H1能感染人并产生病毒血症，但不产生任何症状。

细小病毒的宿主特异性研究表明，MVM和H1选择性杀伤肿瘤细胞和转化细胞，而对正常细胞无明显作用，即具有致瘤性和溶瘤性。

因此，利用野生型病毒杀伤肿瘤和重组细小病毒载体转移外源基因的病毒基因治疗研究越来越多。

H1不仅能抑制动物自发性肿瘤的发生，还能抑制诱发性肿瘤。

众多研究证明，H1能抑制各种类型的肿瘤(肉瘤、癌、白血病)、不同诱因(DNA和RNA肿瘤病毒、化学致癌物)以及人和动物(小鼠、狗)的肿瘤1在体外实验体系中，H1还具有明显的抗肿瘤活性，如转化的成纤维细胞和上皮细胞、人鼻咽癌细胞、人胃癌细胞和肝癌细胞，这些细胞都对H1敏感2，3H1对短期培养的人原发性恶性胶质瘤和胶质肉瘤细胞具有强烈的剂量依赖性杀伤作用。

近十年来，德国Rommelaere博士研究组发现，在细小病毒中引入一些外源基因，如IL-MCP-IP-106等，得到的重组病毒的抗肿瘤活性远高于野生型病毒。

表达细胞因子的重组病毒感染肿瘤细胞后，能引起小鼠的细胞免疫反应，明显抑制肿瘤的生长。

虽然H1病毒的宿主广泛，但不同的细胞对H1有不同的易感性。

Cornelis等人7表明，成纤维细胞和上皮细胞对H1感染的易感性是不同的。

作者比较了病毒mRNA在细胞中的表达，表明易感性的差异与病毒结构和非结构蛋白的转录水平有关，而与病毒的摄入、基因产物在细胞中的定位、病毒mRNA的稳定性和非结构蛋白NS1的磷酸化无关。

与H1不敏感的细胞相比，病毒DNA在H1敏感的角质形成细胞中的复制和扩增没有变化。

因此，这些细胞对H1的易感性主要与病毒基因组的转录水平有关。

研究还表明，p53在宿主细胞中的功能与细小病毒耐药性密切相关。

本研究初步确定了几种胶质母细胞瘤细胞系对野生型MVM和H1的易感性，并探讨了细小病毒MVM和H1治疗胶质母细胞瘤的可能性。

结果表明，UU373和GL261细胞对细小病毒H1或MVM敏感，U87细胞次之，A172和MT539细胞不敏感。

这些细胞易感性差异的原因需要进一步研究。

下一步将研究病毒在细胞中的转录以及细胞基因表达的差异。

考虑到野生型病毒进入肿瘤细胞可能产生亚病毒，新病毒引起的二次感染可以增强细胞毒作用。

因此，我们通过蚀斑形成实验测量了病毒感染后5天(MOI=细胞和细胞培养上清液中的病毒总量。

结果表明，我们检测的大多数细胞系在病毒感染5天后病毒总量略小于初始感染量，说明它们没有产生亚病毒，进入细胞的病毒可能被部分降解。

U373和GL261细胞在感染5天后具有比初始病毒量稍大的病毒量，这表明这两种细胞具有产生亚病毒的能力。

虽然人们对细小病毒H1的研究时间不长，但现有的研究结果表明，细小病毒H1是唯一没有致瘤成员的DNA病毒。

而且细小病毒只在肿瘤细胞中起毒性作用，对正常细胞没有影响，不整合到宿主染色体中，没有插入突变的风险。

到目前为止，尚未发现细小病毒对人类有致病性，因此很有希望成为一种新的抗肿瘤药物。

本研究结果初步提示UUGL261和U87细胞可作为细小病毒治疗胶质母细胞瘤的细胞模型。

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3WrzesinskiC，TesfayL，SalomeN，等.嵌合型和假型细小病毒可最大限度地减少复制型病毒对重组病毒的污染，并鉴定出一种在小鼠细胞中限制细小病毒H-1的DNA序列J.病毒学杂志，20XX，77(:3851-3858。

4HaagA，MentenP，VanDammeJ，等.通过自主细小病毒载体在人肿瘤细胞中高效转导和表达细胞因子基因；在受体小鼠中产生抗肿瘤反应J.人类基因疗法，20XX，11(:597-609。

5WetzelK，MentenP，OpdenakkerG，等.细小病毒载体转导人MCP-3诱导白细胞浸润并降低人宫颈癌细胞异种移植物的生长J.基因医学杂志，20XX年，3(:326-337。

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7科内利斯，陈永庆，N，等.人细胞对细小病毒H-1和小鼠细小病毒杀伤的敏感性与病毒转录的相关性J.病毒学杂志，1990年，第64卷第6期，第2537-2544页。

8MartaHY，JanJC，ChristelHM，等.细小病毒H-1感染人神经胶质瘤细胞导致病毒完全复制和有效的细胞杀伤J.国际癌症杂志，20XX，76-84。