临床医学论文-脐带源间充质干细胞促进造血细胞在NOD-SCID小鼠归巢.doc

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1、临床医学论文-脐带源间充质干细胞促进造血细胞在NOD/SCID小鼠归巢作者：张浪辉，陈志哲，吕璐璐，王爱萍，韩忠朝，刘拥军【关键词】间充质干细胞；,脐带；,造血干细胞；,受体,淋巴细胞归巢；,移植摘要:目的探讨脐带源间充质干细胞（hUCMSC）在促进造血细胞归巢，提高造血干细胞植入中的作用。

2、方法RTPCR检测经体外培养扩增所得hUCMSC归巢相关分子的表达；将hUCMSC和CFDASE荧光标记的人脐带血单个核细胞（MNC）植入NOD/SCID小鼠建立共移植模型，分离共移植24h后小鼠骨髓有核细胞，用流式细胞仪和荧光倒置显微镜观察脐带血造血细胞在NOD/SCID小鼠骨髓中含量的变化。

3、结果hUCMSC表达SDF1及其受体CXCR4以及相关黏附分子CD11a/ICAMCD49d/VCAM1；在hUCMSC共移植情况下，流式细胞仪检测和荧光显微镜下细胞计数均发现人脐带血MNC在小鼠骨髓中的含量与单独脐带血移植相比较有显著提高（/1105vs(/1105；(/5105vs()/5105个骨髓有核细胞；n=9,P95%细胞呈绿色荧光标记，提示标记完成。

标记后细胞经PBS洗涤后定容为1108mL-1，重悬备用。

4、3hUCMSC的培养和胰酶消化对数生长期P3代hUCMSC经25%胰酶1mmol/LEDTA消化，PBS重悬定容为5106mL-1，备用。

细胞取材与培养同2。

4NOD/SCID小鼠共移植分3组，经尾静脉注射移植细胞（表。

5、表1NOD/SCID小鼠共移植分组（略）4移植后NOD/SCID小鼠骨髓中人脐带血MNC的示踪检测1流式细胞仪检测人脐带血MNC在NOD/SCID小鼠骨髓中的含量细胞移入24h后常规断颈处死小鼠，游离小鼠下肢长骨，开放髓腔，用PBS反复洗脱收集骨髓细胞，经红细胞裂解液裂解红细胞后，制成骨髓有核细胞悬液，分置2份，取其中1份细胞悬液经PBS1mL洗涤后，PBS400L重悬，移至流式上样管，上流式细胞仪（FACScan,美国BectonDickinson），在绿色荧光激发下检测经CFDASE标记的人脐带血MNC在小鼠骨髓有核细胞中的含量。

6、142荧光倒置显微镜计数取上述另1份骨髓有核细胞悬液定量为5105mL-1，接种1mL于24孔板中，静置30min，使细胞沉淀于底部，置荧光倒置显微镜(日本OLYMPUS)下，经由绿色荧光激发，计数各孔荧光标记阳性细胞。

5统计学处理数据经SPSS0统计软件处理，采用均数t检验。

7、2结果1RTPCR检测hUCMSC促进造血植入相关分子表达hUCMSC表达化学趋化因子SDF1及其受体CXCR4以及黏附分子CD11a/ICAM1(CD、CD49d/VCAM1(CD（图。

8、CD106;SDF1;CXCR4;CD11a;CD49d;CD54;actin;DL20XXMARK(bp):20XX,1000,750,500,250,100图1RTPCR检测hUCMSC促进造血植入相关分子的表达（略）2流式细胞仪检测NOD/SCID小鼠骨髓中人脐带血MNC含量在hUCMSC共移植情况下，经CFDASE示踪标记的人脐带血MNC在NOD/SCID小鼠骨髓有核细胞中的含量与单独脐带血移植组相比较由(/1105增加至(/个有核细胞（n=9,P（图。

A：空白组，未检出人脐带血MNC（经CFDASE标记的阳性细胞）；B：共移植组，收集55000个细胞，共检出161个阳性细胞，阳性率为30%；C：对照组，收集55000个细胞，共检出83个阳性细胞，阳性率16%.图2流式细胞仪检测1例配对NOD/SCID小鼠骨髓中人脐带血MNC阳性率（略）3荧光倒置显微镜检测NOD/SCID小鼠骨髓中人脐带血MNC含量CFDASE示踪标记的人脐带血MNC在荧光倒置显微镜下发绿色荧光，镜下可见与单独脐带血移植组相比较，hUCMSC共移植组NOD/SCID小鼠骨髓有核细胞中人脐带血MNC含量明显增多（图，细胞计数显示阳性细胞数由单独脐带血移植组的(/5105提高到共移植组的()/5105个有核细胞（n=9,P。

A：实验组；B：对照组图3荧光倒置显微镜检测1例配对NOD/SCID小鼠骨髓中脐带血MNC分布（（略）3讨论影响造血干细胞移植成功的因素很多，而移植初期的造血细胞正确归巢定位对于移植后的造血重建有效恢复、提高移植存活率是至关重要的环节6。

因此，如何提高造血细胞在受者骨髓造血微环境中的有效定位（归巢），成为急需解决的重大课题。

MSC是来源于发育早期中胚层的一类多能干细胞，具有自我更新、高度增殖和多分化潜能的特点，可被广泛用于多系统疾病的治疗78。

有研究表明，骨髓来源的MSC具有分泌化学趋化因子SDF1，表达其受体CXCR4及其他相关黏附分子的特性，通过表达这些归巢相关分子，骨髓MSC可引导造血干祖细胞准确归巢，从而促进造血干细胞的有效植入910。

笔者通过RTPCR技术检测，发现hUCMSC同样表达SDF1和其受体CXCR4，以及CD11a、CDCD49d、CD106等黏附分子。

推测hUCMSC通过自身CXCR4及相关黏附分子在实现自身有效归巢后（笔者通过NOD/SCID小鼠模型证实了hUCMSC的归巢效应），通过进一步分泌SDF1，表达相关黏附分子及细胞外基质成分修复因疾病和治疗的影响遭受损坏的造血微环境，引导造血细胞归巢于“造血细胞龛”中，实现造血细胞的有效植入11。

为了印证hUCMSC促进造血细胞有效归巢的效应，笔者建立了hUCMSC与脐带血MNC共移植NOD/SCID小鼠动物模型。

通过细胞示踪技术，检测移植后24h与单独脐带血移植比较，hUCMSC的共移植可以提高人脐带血MNC在NOD/SCID小鼠骨髓有核细胞中的含量，提示hUCMSC可能具有引导造血细胞在NOD/SCID小鼠体内向造血龛骨髓富集（归巢）的作用。

笔者选用MNC作为造血细胞的指标，是考虑到目前临床进行的造血干细胞移植绝大部分是采用包含多种细胞成分的单个核细胞来进行的。

这些进入小鼠骨髓内的阳性细胞在多大程度上可代表具有支持长期造血重建的所谓造血干祖细胞，还有待对造血干/祖细胞标志的进一步认识，以及本课题研究的进一步深入。

相信伴随着对hUCMSC促进干/祖细胞归巢机制认识的不断深入，hUCMSC共移植治疗在造血干细胞移植中的应用将进一步拓展，这对于提高临床造血干细胞移植成功率具有十分重要的意义。

参考文献：1AbkowitzJ,RobinsonA,KaleS,etal.MobilizationofhematopoieticstemcellsduringhomeostasisandaftercytokineexposureJ.Blood,20XX,.2WrightDE,WagersAJ,PathakGulatiA,etal.PhysiologicalmigrationofhematopoieticstemandprogenitorcellsJ.Science,20XX,.3CartonG,HeraultO,BenboubkerL,etal.QuantitiveandqualitiveanalysisofthehumanprimitiveprogenitorcellpartmentafterautologousstemcelltransplantationJ.JHematotherStemCellRes,20XX,4NilssonSK,JohnstonHM,CoverdaleJA.Spatiallocalizationoftransplantedhemopoieticstemcells:inferencesforthelocalizationofstemcellnichesJ.Blood,20XX,.5吕璐璐,刘拥军,许贞书,等.脐带源间充质干细胞的分离和生物学性状的研究J.福建医科大学学报,20XX,40(:6KahnJ,BykT,LottieJ,etal.OverexpressionofCXCR4onhumanCD34+progenitorsincreasestheirproliferation,migration,andNOD/SCIDrepopulationJ.Blood,20XX,.7KocON,DayJ,NiederM,etal.Allogeneicmesenchymalstemcellinfusionfortreatmentofmetachromaticleukodystrophy(MLD)andHurlersyndrome(MPSIH)J.BoneMarrowTransplant,20XX,8ChenSL,FangWW,YeF,etal.EffectonleftventricularfunctionofintracoronarytransplantationofautologousbonemarrowmesenchymalstemcellinpatientswithacutemyocardialinfarctionJ.AmJCardiol,20XX,9BroxmeyerH,KohliL,KimC,etal.Stromalcellderivedfactor1/CXCL12directlyenhancessurvival/antiapoptosisofmyeloidprogenitorcellsthroughCXCR4andGaiproteinsandenhancesengraftmentofpetitive,repopulatingstemcellsJ.JLeukocBiol,20XX,10LapidotT,KolletO.TheessentialrolesofthechemokineSDF1anditsreceptorCXCR4inhumanstemcellhomingandrepopulationoftransplantedimmunedeficientNOD/SCIDandNOD/SCID/B2m(null)miceJ.Leukemia,20XX,.11VerfaillieCM.AdhesionreceptorsasregulatorsofthehematopoieticprocessJ.Blood,1998,.。