临床医学论文-脂肪源间充质干细胞治疗aGVHD分子机制的初步研究.doc

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1、临床论文脂肪间充质干细胞治疗aGVHD分子机制的初步研究作者:方柏君、宋永平、林德、曹颖【关键词】间充质干细胞；TCR，V基因；移植物抗宿主病；摘要目的:探讨成人脂肪间充质干细胞(AMSC)治疗急性移植物抗宿主病(aGVHD)的分子机制。

2、方法:对3例异基因造血干细胞移植后aGVHD患者给予AMSC；静脉注射剂量为每公斤体重2106个细胞。

3、采用Rt-PCR方法扩增AMSC患者用药前后外周血单个核细胞TCRV24亚家族的CDR3，了解TCRVT细胞在患者体内的分布情况。

结果:aGVHD患者表达TCRV3及其他亚家族基因。

AMSC输注后，GVHD得到有效控制，但V3不表达。

当GVHD复发时，V3基因再次表达，但不是在治疗后。

4、结论:AMSC治疗aGVHD的分子机制可能与其抑制TCRV亚家族基因表达有关，TCRV3可能是AMSC的靶基因。

5、【关键词】间充质干细胞；TCRV基因；移植物抗宿主病；成人脂肪间充质干细胞治疗急性移植物综合征的分子机制研究摘要:目的探讨成人脂肪间充质干细胞(AMSC)治疗急性移植物综合征的分子机制。

方法静脉注射2106AMSC/kgAGVHD患者体重。

6、应用RTPCR技术扩增TCRV24亚家族基因CDR3，检测3例异基因造血干细胞移植后GVHD患者的TCRVT谱分布。

7、结果发现在GVHD明显时有TCRV3基因及其他亚家族基因的表达，但经AMSC治疗GVHD缓解后未检测到，而在GVHD复发时，V3基因的表达重新出现，但治疗后消失。

8、结论AMSC治疗GVHD的分子机制可能与抑制TCRV亚家族基因表达有关，TCRV3基因可能是AMSC的靶基因。

关键词:间充质干细胞；TCRV基因；GVHD脂肪性急性移植物抗宿主病是异基因造血干细胞移植后患者死亡的最重要原因之一。

20XX年5月，Ringden等人报道骨髓间充质干细胞可以有效控制重症AGVHD1最近，我们从成人脂肪组织中分离出免疫表型为Flk1+CD31CD34的细胞亚群。

体外实验证明其具有骨髓间充质干细胞的所有特征2，因此将其定义为成人脂肪组织来源的间充质干细胞(AMSC)。

本研究采用AMSC治疗3例aGVHD患者，取得了良好的效果。

通过基因扫描技术分析这3例患者使用AMSC前后TCRV基因的变化，初步探讨了骨髓间充质干细胞在体内控制aGVHD的分子机制。

1材料和方法1amsc的分离培养2参照本实验室已建立的方法:抽取适量皮下脂肪组织，切成片，用DHanks溶液洗去血细胞，用2%型胶原酶消化2h，洗去胶原酶，用FicollPaque(077g/ml)分离液分离单核细胞。

分别用CD45和GlyA磁珠(MiltenyiBiotec)去除CD45+和GlyA+细胞，将阴性选择获得的细胞接种到96孔细胞培养板(每孔一个细胞)，96孔板预包被ECM胶含有5ng/mlBMP4(sigma)、30ng/mlSCF(sigma)和3%FCS(Gibco)20天后，选择单克隆细胞并扩增以备后用。

培养基的成分是:40%MCDB(Gibco)，56%DF12(Gibco)，4%FCS(Gibco)，20ng/mlIL6(适马)2病例1，女，43岁，确诊慢性粒细胞白血病(慢性期)1年，后在同胞间进行HLA相合的外周造血干细胞移植。

aGVHD的预防按常规方法进行，即环孢素A(CsA，3mg/kg/d，从-5d开始)+甲氨蝶呤MTX，15mg/m2，+1d；移植后(+10毫克/平方米，+3天，+6天，+11天)在+7天，患者出现腹部绞痛和腹泻，用抗痉挛药物治疗无效。

结肠镜活检结果显示AGVHD给予甲基强的松龙120mg/d，未见缓解。

+12天后，患者胸背部出现红色斑丘疹；分别在+18天和+26天给患者服用两次达珠单抗(1mg/kg)。

效果不明显，患者病情进行性加重。

+34天后，对患者静脉注射相同造血干细胞供体的AMSC，剂量为2106/千克体重。

2天后胃肠道症状缓解，1周内皮疹消退。

+72天后，患者出现胃肠道症状，皮肤粗糙瘙痒，四肢及面部出现明显斑丘疹，并伴有明显食欲不振。

患者接受了相同造血干细胞捐献者的AMSC静脉注射，剂量为每公斤体重2106。

皮疹一周内消退，消化道症状明显改善。

之后患者病情稳定。

病例2，23岁男性急性髓系白血病患者，在首次完全缓解的基础上，在同胞中进行HLA相合的外周造血干细胞移植。

移植后+92天出现消化道型AGVHD。

在甲泼尼龙、FKZeniperazine无效时，于+121天给予AMSC(2106/kg)一次，一周后腹泻、腹痛症状完全消失。

例3，35岁男性急性髓系白血病患者，在第二次完全缓解的基础上，在同胞间进行HLA相合的外周造血干细胞移植，移植后+49天出现级肝脏aGVHD。

当甲泼尼龙、FK506和赛尼哌无效时，在+75天给予一次AMSC(2106/kg)。

一周后病情明显缓解，两周后肝功能异常。

3RNA提取和cDNA合成3例患者发生aGVHD后，AMSC治疗前后分离外周血单个核细胞，用TRIzolkit(Gibco)按常规方法提取RNA，用随机引物和逆转录酶试剂盒(Gibco)合成第一链cDNA，2微球蛋白基因作为内参。

4逆转录聚合酶链反应(RTPCR)根据24V亚家族基因设计24V特异性上游引物，将C下游引物设置在C区。

引物由上海龚升生物公司合成。

每份标本用V124/C24引物对进行24次PCR检测。

根据参考文献3进行PCR总反应体积为25l，其中包含1lcDNA，1mmol/LdNTP(包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP)，5mol/L引物浓度(任何V引物和C引物)，2U聚合酶，其在PCR缓冲液(1mmol/LTrisHCL，pH35mmol/LKCL，5mmol/LMgC12和001%明胶)(试剂为上海龚升和Gibco的产品)中反应，总共40个循环，941分钟为每个反应设置阳性和阴性对照。

引物序列如下:V5CCGCACAACAGTTCCCTGActTGC3；v5gccACATACTAGCAAGGCGTCGA3；v5cgcTTCTCCCGCATTCTGGAGTCC3；v5TTCCCATCAGCCGCCCAAACCtaa3；v5CTCTGAGCTGAGCTGAATGTGAACGC3；v5TCTCAGGTGTGATCCAAATTCggG3；v5CCTGAATGCCCCAACAGCTCTCTC3；v5CCTGATGCGGGCTGGAGTtgc3；v5TTCCCTGGAGCTTGGTGACTCTGC3；v5CCACGGAGTCAGGGACACAGCAC3；v5tgcCAGCCCTCACATACCTCTCA3；v5TGTCACCAGACTGGGAACCACCAC3；v5CACTGCGGTGTACCCAGGATATGA3；v5GGGCTCGGCTTAAGGCAGACCtac3；v5CAGGCACAGGCTAAATTCTCCCTG3；v5gccTGCAGAACTGGAGGATTCTGG3；v5ctgCTGAATTTCCCAAAGAGGgcc3；v5tgcCCCAGAATCTCTCAGCCTcca3；V5TCCTCTCACTGT广汽ATCGGCcca3；v5AGCTCTGAGGTGCCCCAGAATCTC3；v5TCCAACCTGCAAGGCTTGACGact3；v5aagTGATCTTGCGCTGTGTCCcca3；v5GCAGGGTCCAGGTCAGGACCCCA3；v5CCCAGTTTGGAAAGCCAGTGACCC3；C:5CGGGCTGCTCCTTGAGGGGCTGCG3结果在病例1中，TCRV基因分析显示aGVHD患者外周血单个核细胞表达TCRV14和15。

当消化道症状缓解，皮疹消退时，TCRV基因分析显示V3及以上基因不表达。

在复发+69天的患者中，TCRV3和V8再次表达。

经过AMSC治疗，病情稳定。

V3基因不表达，但V14和15表达。

在病例2中，当aGVHD发生时，TCRV基因分析显示V22和23的表达；AMSC执政后，aGVHD得到了有效控制。

TCRV基因分析显示，V3不表达，但V14和15表达。

病例3中，aGVHD发生时，TCRV基因分析显示V23表达；AMSC执政后，aGVHD症状消失。

TCRV基因分析显示，V3不表达，但V14和15表达。

讨论异基因造血干细胞移植是治疗各种恶性血液肿瘤的有效方法，但其主要并发症移植物抗宿主病是严重影响患者长期生存和生活质量的重要因素。

虽然CsA联合短期MTX或(和)类固醇激素是预防aGVHD的经典方案，但使用该方案后，aGVHD的发病率和死亡率仍然较高。

例如，在HLA相合的供者和受者的异基因造血干细胞移植中，急性度aGVHD的发生率可达78%，急性度aGVHD为36%，慢性aGVHD为64%。

对于aGVHD患者，随着CsA剂量的增加，CsA对肝肾的毒性明显增强。

大剂量应用类固醇激素易诱发严重感染和继发性糖尿病。

此外，新的免疫抑制剂如zenapa(抗Tac单克隆抗体)价格昂贵，不能被大多数患者接受。

因此，对于大多数患者来说，寻找高效低毒的新型免疫抑制剂成为当务之急。

大量研究证实，MSC在体内外均具有显著的免疫调节作用，可有效预防和控制aGVHD的发生和发展。

其作用机制过去主要集中在抑制由同一抗原刺激的T淋巴细胞或B淋巴细胞的增殖和T淋巴细胞亚群的变化1，410免疫学方面的大多数学者认为，aGVHD与不同TCRV亚家族的克隆性T细胞异常表达有关，但仍无确切证据。

国内李等报道慢性aGVHD患者存在部分TCRV亚家族T细胞克隆性增殖11，提示aGVHD与部分TCRV亚家族相关，但由于研究病例较少，无明确规律性。

结果首次提示成人脂肪间充质干细胞可有效控制aGVHD，其分子机制可能与抑制TCRV亚家族基因表达有关。

具体来说，当患者出现aGVHD时，TCRV3和其他亚家族基因就会表达。

AMSC治疗后，aGVHD缓解，但V3基因不表达。

当aGVHD患者复发时，V3基因再次表达，治疗后再次消失。

结果表明，AMSC可能通过影响TCRV3基因的表达抑制T细胞功能，起到抗aGVHD的作用，但这一结果尚需积累更多的临床资料来证实。

参考文献:1林登O，乌祖内尔M，拉斯姆森I，等.骨髓间充质干细胞治疗难治性移植物疾病j.移植，20XX，81(:。

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表位模拟被认为是自身免疫性疾病的一个组成原因:免疫介导的(1型)糖尿病J。

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9ShohamT，ParameswaranR，ShavTalY，等.间充质基质通过活化素A的表达负调节B细胞淋巴细胞生成J.安纽约科学学院，20XX年，245260。

10RasmussonI，RingdenO，SundbergB，等.间充质干细胞抑制细胞毒性T淋巴细胞的形成，但不抑制活化的细胞毒性T淋巴细胞或自然杀伤细胞J.移植，20XX，76(:。

11李，许等.cGVHD患者TCRV6，16，17，19和21表达的基因扫描分析。