临床医学论文-脂肪源间充质干细胞治疗aGVHD后T细胞亚群的变化.doc

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1、临床论文-脂肪间充质干细胞治疗aGVHD后T细胞亚群的变化作者:方柏君，宋永平，魏旭东，张伟，曹颖【关键词】间充质干细胞；移植物抗宿主病；CD8+CD28-T淋巴细胞；CD4+CD25+T淋巴细胞目的:探讨脂肪间充质干细胞(AMSC)治疗急性移植物抗宿主病(aGVHD)的机制。

2、方法:对3例异基因造血干细胞移植后aGVHD患者给予AMSC；静脉注射剂量为每公斤体重2106个细胞。

3、首先用尼龙毛柱分离外周血中的T淋巴细胞，然后用CD4或CD8免疫磁珠分离CD8+或CD4+T淋巴细胞。

4、流式细胞仪检测aGVHD患者AMSC前后外周血CD8+和CD4+T细胞亚群的变化。

5、结果:与输注AMSC前相比，输注AMSC后，CD8+T细胞的CD8+CD28-CD25-亚群明显上调，而CD4+T细胞的CD4+CD25+亚群变化不明显。

同时，患者的aGVHD得到有效控制。

6、结论:AMSC治疗aGVHD的机制可能与其上调CD8+CD28-T细胞亚群有关，而与CD4+CD25+亚群无直接关系。

7、【关键词】间充质干细胞；移植物抗宿主病；CD8+CD28-T淋巴细胞；成人脂肪间充质干细胞治疗急性移植物抗宿主病后CD4+CD25+T淋巴细胞亚群的变化摘要:目的探讨间充质干细胞(AMSC)治疗急性移植物抗宿主病(aGVHD)的分子机制。

8、方法对2106例急性移植物抗宿主病患者采用AMSC哌卡因静脉注射。

用尼龙柱收集T细胞，磁珠分选CD8+或CD4+T细胞，用荧光激活细胞分选仪(FACS)检测3例aGVHD患者异基因造血干细胞移植后CD8+CD28-T细胞或CD4+CD25+T细胞的比例。

结果流式细胞仪数据显示，AMSC移植后CD8+T细胞中CD8+CD28-T细胞显著上调，而CD4+T细胞亚群中CD4+CD25+T细胞比例无显著变化。

同时，观察到aGVHD疾病完全缓解。

结论AMSC成功治疗aGVHD的机制可能与体内CD8+CD28T细胞的上调有关，但供者CD4+CD25+T细胞的频率与MSC的临床预后无明显相关性。

关键词:间充质干细胞；GVHDCD8+CD28-T淋巴细胞；CD4+CD25+T淋巴细胞骨髓间充质干细胞能有效预防和治疗严重急性移植物抗宿主病(aGVHD)的观点已被大多数血液学学者接受1最近，我们从成人脂肪组织中分离出免疫表型为Flk1+CD31-CD34-的细胞亚群。

体外实验证明其具有骨髓间充质干细胞的所有特征2，因此将其定义为成人脂肪组织来源的间充质干细胞(AMSC)。

本研究采用AMSC治疗3例aGVHD患者，取得了满意的效果。

采用流式细胞术检测了3例aGVHD患者使用AMSC前后外周血CD4+和CD8+T细胞亚群的变化，并初步探讨了间充质干细胞(MSC)参与体内控制aGVHD的机制。

1材料和方法1amsc的分离培养2参照本实验室已建立的方法:抽取适量皮下脂肪组织，切成片，用DHanks液洗去血细胞，用2%型胶原酶消化2小时，洗去胶原酶，用FicollPaque(077g/ml)分离液分离单核细胞。

用CD45和GlyA磁珠(MiltenyiBiotec)分选去除CD45+和GlyA+细胞，将阴性选择得到的细胞接种于96孔细胞培养板(每孔1个细胞)，96孔板预包被ECM胶含5ng/mlbmp4(sigma)，30ng/mlSCF(sigma)，3%FCS(gibco)。

20天后，选择单克隆细胞并扩增以备后用。

培养基的成分是:40%MCDB(Gibco)，56%DF12(Gibco)，4%FCS(Gibco)，20ng/mlIL6(适马)2病例1，女，43岁，在确诊慢性粒细胞白血病(慢性期)1年后，在同胞间进行HLA相合的外周造血干细胞移植，按常规方法进行GVHD预防，即环孢素A(CsA，3mg/kg/d，-5天)+甲氨蝶呤MTX，15mg/m2，+1天；移植后(+110毫克/平方米，+3天，+6天，+11天)在+7天，患者出现腹部绞痛和腹泻，用抗痉挛药物治疗无效。

结肠镜活检结果显示AGVHD给予甲基强的松龙120mg/d，未见缓解。

+12天后，患者胸背部出现红色斑丘疹；分别在+18天和+26天给患者服用两次达珠单抗(1mg/kg)。

效果不明显，患者病情进行性加重。

+34天，对患者静脉注射相同造血干细胞供体的AMSC，剂量为每千克体重2106。

2天后胃肠道症状缓解，1周内皮疹消退。

+72天后，患者出现胃肠道症状，皮肤粗糙瘙痒，四肢及面部出现明显斑丘疹，并伴有明显食欲不振。

患者接受了相同造血干细胞捐献者的AMSC静脉注射，剂量为每公斤体重2106。

皮疹一周内消退，消化道症状明显改善。

之后患者病情稳定。

病例2，23岁男性急性髓系白血病患者，在首次完全缓解的基础上，在同胞中进行HLA相合的外周造血干细胞移植。

移植后+92天出现消化道型AGVHD。

在甲泼尼龙、FKZeniperazine无效时，于+121天给予AMSC(2106/kg)一次，一周后腹泻、腹痛症状完全消失。

例3，35岁男性急性髓系白血病患者，在第二次完全缓解的基础上，在同胞间进行HLA相合的外周造血干细胞移植，移植后+49天出现级肝脏aGVHD。

当甲泼尼龙、FK506和赛尼哌无效时，在+75天给予一次AMSC(2106/kg)。

一周后病情明显缓解，两周后肝功能异常。

3CD4+或CD8+T淋巴细胞的分离及其亚群的检测。

采集aGVHD患者输注AMSC前后的外周血，用FicollPaque(077g/ml)溶液分离获得单核细胞，用DHanks溶液洗涤两次。

在含有10%胎牛血清、100U/ml链霉素和100U/ml青霉素的RPMI1640(Gibco)完全培养基中培养，2小时后，收集悬浮细胞，通过尼龙毛柱获得T淋巴细胞，然后与CD8或CD4免疫磁珠(MiltenyiBiotec)孵育30分钟，然后使用磁珠分别分选CD4+或CD8+T淋巴细胞。

用PBS洗涤后，在黑暗中与PE标记的抗CD4或CD8抗体、FITC标记的抗CD25或CD28抗体和相应的同型对照(双克隆)反应30分钟。

用PBS洗涤2次后，用流式细胞仪检测(每个患者取2个样本，每个样本3次)，分别分析CD8+CD28-和CD4+CD25+T细胞的百分比。

4统计处理应用SPSS软件分析结果结果均数标准差显示组间比较采用配对T检验，差异显著，P05。

结果病例1中，与AMSC输注前相比，AMSC输注后2天，aGVHD明显缓解，外周血CD8+T细胞中CD8+CD28-T细胞亚群明显上调(图1a)。

然而，CD4+CD25+T细胞的百分比在AMSC输注前为(%，在AMSC输注后两天为(%，两者之间没有显著差异。

复发+72天的患者接受AMSC治疗。

两天后，流式细胞仪结果显示CD8+T细胞中的CD8+CD28-亚群显著上调，而CD4+CD25+T细胞的百分比在AMSC输注前后保持不变。

同时，输注AMSC后，患者皮疹在一周内基本完全消退，消化道症状明显改善。

目前(+156d)患者生活状态尚好，GVHD未复发。

在病例2中，当发生aGVHD时，在CD8+T细胞中仅发现(%的CD8+CD28-T细胞。

输注AMSC后第2天，CD8+CD28-T细胞百分比上升至(%，差异有显著性。

在病例3中，在aGVHD开始时，在CD8+T细胞中仅发现(%CD8+CD28-T细胞。

输注AMSC2d后，检测结果显示CD8+CD28-T细胞比例上升至(%，aGVHD症状明显改善。

而AMSC输注前病理2和3中CD4+CD25+T细胞百分比分别为(%和(%，AMSC输注后第2天检测结果分别为(%和(%，无显著差异。

图1输注AMSC后，患者外周血CD8+T细胞中的CD8+CD28-T细胞亚群显著上调(a.对照；b.在输注AMSC之前；输注AMSC后)(略)3讨论异基因造血干细胞移植是治疗各种恶性血液肿瘤的有效方法，但其主要并发症移植物抗宿主病是严重影响患者长期生存和生活质量的重要因素。

CD4+CD25+T和CD8+CD28-T细胞是近年来引起越来越多关注的调节细胞。

研究表明CD4+调节性T细胞诱导免疫抑制，而CD8+调节性T细胞是发挥免疫抑制作用的效应细胞3最近，我们的体外实验结果表明，AMSC可以显著上调CD4+T细胞亚群中的CD4+CD25+T细胞，而CD4+CD25+T细胞可以有效地预防和治疗体内GVHD4Lewis等人5观察到无症状HIV感染成人中CD28表达的缺失，这种抗CD28刺激反应的缺失与AIDS的进展有关。

自身免疫性疾病是淋巴细胞对内源性抗原发生反应而引起的疾病，淋巴细胞数量和功能的变化在该病的发病中起一定作用。

在多发性硬化、克罗恩病、重症肌无力复发病例中，发现患者CD8+T抑制淋巴细胞数量减少或功能受损。

Filaci等6研究表明，活动期系统性红斑狼疮患者CD8+抑制性T淋巴细胞失去抑制活性，其活性的变化与可溶性分子有关。

与活动期相比，恢复期系统性红斑狼疮患者体内产生CD8+T抑制淋巴细胞，表明CD8+CD28-T细胞在系统性红斑狼疮的发病中起重要作用，且患者体内CD8+T抑制淋巴细胞的变化是可逆的，为MSC治疗自身免疫性疾病提供了理论依据。

MSC可能通过上调患者体内CD8+CD28-T细胞发挥其免疫抑制作用。

我们早期的体外研究表明，在MSC存在的情况下，CD8+CD28-T细胞显著上调，在PHA刺激下，与未经MSC处理的T细胞组相比，经PHA处理后，与MSC共培养的T细胞中CD8+CD28-亚群细胞的比例显著增加7，这表明CD8+CD28-亚群的上调是MSC发挥其抑制作用的重要环节。

研究结果首次提示，AMSC能有效控制体内aGVHD的发展，其机制可能与其显著上调CD8+CD28-T细胞亚群有关，而与CD4+CD25+亚群的变化无直接关系。

CD8+T细胞可能是AMSC的靶细胞，但这一结果需要积累更多的临床数据来证实。

参考文献:1LeBlancK，RingdenO.人骨髓间充质干细胞的免疫生物学及其在造血干细胞移植中的应用J.生物血液骨髓移植，20XX，321334。

2曹勇，孙智，廖磊，等.人脂肪干细胞体外诱导分化为内皮细胞及体内促进新生血管形成的实验研究J.生物化学生物物理学会，20XX，370379。

3谭平，AnasettiC，MartinPJ，等.尽管阻断了IL2受体，同种异体抗原特异性T抑制诱导细胞和T抑制效应细胞仍可被激活J.免疫学杂志，1990年，485488。

4KarakhanovaS，MunderM，SchneiderM，等.高效扩增人CD4+CD25+调节性T细胞用于移植性宿主病患者的细胞免疫治疗J.免疫学杂志，20XX，336349。

5德，唐，等.艾滋病病毒感染者CD8+T细胞的无能与凋亡J.免疫学杂志，1994年，412420。

6菲拉奇G，巴奇列里S，弗拉维加M，等。

活动性系统性红斑狼疮患者CD8+t抑制细胞功能的影响j.免疫学杂志，200，。

7张伟，葛伟，等.骨髓间充质干细胞通过上调CD8+CD25-T细胞抑制T细胞增殖J。

实验血液学杂志，20XX，12(:666669。