
临床医学论文-脂氧合酶抑制剂NDGA对HT.doc





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1、临床论文脂氧合酶抑制剂对HT的影响作者:夏光涛、张、吴森森、张【摘要】目的:探讨脂氧合酶抑制剂对结肠癌HT29细胞株体外生长抑制和凋亡的影响。
方法:用MTT法绘制生长曲线。
倒置相差显微镜观察细胞形态变化。
扫描电镜观察细胞超微结构变化,检测凋亡小体。
流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期变化。
2、结果:不同浓度NDGA处理后的HT29结肠癌细胞随着药物浓度的增加,形态变圆,体积变小,逐渐从瓶壁脱落,肿瘤细胞凋亡率逐渐增加,癌细胞被阻滞在G0/G1期。
扫描电镜可见凋亡小体的形成。
3、结论:NDGA能抑制结肠癌HT29细胞的生长并诱导其凋亡,且随着药物浓度的增加,凋亡率逐渐增加。
具有剂量依赖效应。
4、【关键词】脂氧合酶抑制剂NDGA诱导结肠癌细胞株HT29凋亡的研究【摘要】目的:从细胞生长抑制、细胞凋亡等方面探讨脂氧合酶抑制剂NDGA(去甲二氢愈创木酸)对结肠癌细胞株HT29的体外作用。
方法:分别应用。
MTT法绘制生长曲线。
5、倒置相差显微镜观察细胞形态学变化,扫描电镜观察细胞超微结构和凋亡小体的变化。
流式细胞仪检测细胞凋亡和周期性变化。
结果:我们用不同浓度的NDGA分别处理癌细胞。
6、随着药物浓度的升高,细胞凋亡率逐渐升高,细胞形态变圆,体积变小,从瓶内表面脱落,扫描电镜可见凋亡小体。
细胞生长阻滞在G0/G1期。
7、结论:NDGA能抑制结肠癌细胞株HT29的生长并诱导其凋亡,凋亡率随药物浓度的增加而增加,并呈现剂量依赖效应。
该药物将细胞阻滞在G0/G1期。
8、【关键词】脂氧合酶抑制剂多彩新脂酶花生四烯酸代谢可分为环氧化酶(COX)和脂氧合酶(LOX)两条途径。
COX是环氧合酶途径的关键酶。
抑制COX活性可以诱导结肠癌细胞凋亡,抑制癌细胞转移。
国内外学者对此已达成共识。
抑制LOX通路能否抑制结肠癌细胞的生长并诱导其凋亡,国内外鲜有报道。
本文用去甲二氢愈创木酸(NordihydroguaiareticAcid,去甲二氢愈创木酸)处理HT29结肠癌细胞株,研究其是否能抑制肿瘤细胞的生长并诱导细胞凋亡,为临床治疗提供依据。
1材料和方法1仪器设备37CO2培养箱(NV2500E美国)、洁净工作台(YJ-1450s,苏州)、倒置相差显微镜(日本奥林巴斯)、普通光学显微镜(日本奥林巴斯BH、台式高速离心机(HERMLEZK、酶联免疫吸附测定(BIORAD、流式细胞仪(FACScan,BD,美国)、JS。
2材料和试剂1结肠癌细胞系HT29细胞系购自山东省医学科学院肿瘤生物治疗中心。
2主要试剂RPMI1640培养基和胰蛋白酶购自Gibco公司。
新生小牛血清购自中国杭州四季青生物工程材料研究所。
NDGA购自Calbiochem公司,四唑盐(MTT)购自适马公司,碘化丙锭(PI)购自北京悦泰生物制品公司。
3细胞培养常规培养HT29结肠癌细胞。
对处于指数生长期的细胞进行实验,用不同浓度的药物处理后,在CO2培养箱中孵育相应的时间,然后检测相关指标。
4细胞形态学观察1倒置显微镜每6小时用高倍显微镜和低倍显微镜观察HT29结肠癌细胞的形态学变化、细胞生长和培养基。
贴墙后,每4小时观察一次。
药物处理后每2小时观察细胞生长和形态学变化。
2扫描电镜观察显示,NDGA(终浓度为100mol/L)作用48h。
取出对照组和给药组有癌细胞的玻片,用3%戊二醛固定,用1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次,用1%四氧化锇(四氧化锇)固定1小时,用1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次,用乙醇脱水,用乙酸异戊酯代替,在CO2临界点干燥。
5癌细胞凋亡的检测1采用MTT法绘制生长曲线。
实验设计包括5组:空白组(无细胞)、对照组(含PBS溶液)和NDGA组(分别为100mol/L),每组5个平行孔。
用25%胰蛋白酶消化培养瓶中贴壁的结肠癌HT29细胞。
当细胞形态发生变化时,用含小牛血清的培养基中和细胞,吹制成细胞悬液,以104个/ml的浓度接种到96孔培养板中,每孔200l。
培养24小时后,加入不同浓度的药物,分别培养72小时。
然后,取出培养板以检测细胞的光密度(OD)。
实验方法:每孔加入20l新鲜配制的MTT溶液(5mg/ml),37继续培养4h。
小心吸取孔中的上清液,向每个孔中加入DMS0150L,放置振荡器10分钟,使晶体完全溶解。
然后,在酶联免疫吸附试验上用双波长(490,570nm)测量光度密度,并将空白组的OD值调至零。
以时间为横轴,OD值为纵轴,绘制生长曲线。
2流式细胞仪检测癌细胞凋亡率和细胞周期变化。
分别收集经NDGA(100mol/L)处理48小时的HT29结肠癌细胞。
用25%胰蛋白酶消化,然后用含小牛血清的培养液中和,然后加入离心管离心,用PBS溶液冲洗,然后离心5分钟(1000r/min),加入70%冷乙醇固定,4冰箱保存过夜。
用PBS溶液冲洗,用100目筛网过滤,并离心5min(1500转/分钟)加入05mlPI工作液,室温避光30min,电脑上查。
上电脑前用标准荧光微球调整仪器的变异系数,保持在2%以内。
在计算机上采集20XX0个细胞,荧光强度进行对数放大,光散射数据存入软盘。
试验结束后,在Macintosh650计算机上用Modifit软件(由BectonDickinson公司提供)对数据进行分析,并用HP1200c/PS打印结果。
6统计处理定量数据均以xs表示,统计计算用SPSS0统计软件处理,方差分析、t检验、Dunnettt检验等统计处理,p05有统计学意义。
结果1NDGA作用于HT29结肠癌细胞时的形态学观察1对照组HT29结肠癌细胞的倒置显微镜形态学观察为类圆形,部分延伸的癌细胞可呈梭形,贴壁生长。
在NDGA(100mol/L)作用24小时后,细胞开始发生形态变化,表现为细胞变圆变小,细胞内颗粒和空泡增多,细胞粘附力下降,更多的细胞从瓶壁脱落,悬浮在培养基中(图1B)。
随着药物浓度和时间的增加,这种变化越来越明显。
2扫描电镜观察细胞超微结构对照组HT29结肠癌细胞呈贴壁生长,圆形,部分癌细胞伸展成梭形,细胞饱满,表面有丰富的微绒毛。
癌细胞之间连接紧密,表面微绒毛相互交叉。
NDGA(100mol/L)48小时后,癌细胞形成彼此分离的芽状突起。
凋亡小体的形成(图2B)2NDGA诱导HT29结肠癌细胞凋亡1NDG4影响HT29结肠癌细胞的生长曲线。
对照组HT29结肠癌细胞生长迅速,1100mol/LNDGA抑制HT29结肠癌细胞的生长。
各时间段与对照组相比,1mol/L药物治疗组od值呈下降趋势,但与对照组相比无显著性差异。
随着NDGA浓度(10,100mol/L)的增加,OD值与对照组相比有显著差异(P,其中100mol/LNDGA处理组OD值与对照组相比有显著差异(P,表明HT29结肠癌细胞的抑制程度随着药物浓度的增加而增加(见表1和图表1NDGA对结肠癌细胞株HT29od值的影响2HT29结肠癌细胞株凋亡率和细胞周期的变化对照组HT29结肠癌细胞株在G0/G1前出现一个凋亡峰,凋亡率百分比为07。
NDGA(100mol/L)作用48小时后,凋亡峰明显增加,凋亡率百分比为09,与对照组HT29结肠癌细胞株的凋亡率百分比不同。
与对照组相比,S期细胞比例显著降低(P说明NDGA处理后HT29结肠癌细胞凋亡率增加,NDGA可以将HT29结肠癌细胞阻滞在G0/G1期,从而抑制HT29结肠癌细胞的生长(表2,图表2NDGA对HT29细胞凋亡率和细胞周期的影响3论述了花生四烯酸(AA)代谢可以分为环氧化酶(COX)和脂氧合酶(LOX)两条途径。
现已发现,与正常组织相比,睾丸癌、乳腺癌、结肠癌和肺癌组织中LOX的代谢水平明显较高,提示肿瘤的发生可能与花生四烯酸通过LOX途径的代谢有关1,2,3花生四烯酸通过脂肪氧合酶途径进行生化代谢,产生白三烯(LT)和HETE(羟基二十碳四烯酸)。
LOX可分为3个亚型:5LOX、12LOX和15LOX3。
不同类型的肿瘤细胞表达不同的亚型。
本实验选用的NDGA对这三种亚型的酶都有抑制作用。
4国外实验证实结肠癌细胞株HT29具有合成LT的能力,说明该肿瘤细胞中存在LOX的代谢途径,提示该细胞中存在脂肪氧合酶抑制剂位点。
治疗LOX相关肿瘤主要有两种方法。
一种方法是直接应用LT受体拮抗剂。
有学者将SC41930和LTB4拮抗剂应用于结肠癌细胞,可以抑制其生长。
另一种方法是抑制LOX活性。
两者相比,应用LOX抑制剂的作用更直接,可以直接抑制LT的合成,从而诱导肿瘤细胞凋亡,降低其转移能力2将NDGA应用于细胞培养后的HT29结肠癌细胞,研究其诱导凋亡作用的报道较少。
当肿瘤凋亡时,细胞生长周期可以改变。
发现在肿瘤凋亡过程中,肿瘤细胞可以被阻滞在G0/G1期5,6,7,这与本实验结果基本一致。
本实验从细胞形态、超微结构、细胞生长曲线、凋亡率和细胞周期变化等方面证实了NDGA能够抑制HT29结肠癌细胞的生长并诱导其凋亡,且这种作用随着药物浓度的增加而加强,具有剂量依赖性,为LOX的临床应用提供了实验依据。
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