临床医学论文-脂氧合酶抑制剂NDGA对HT.doc

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1、临床论文脂氧合酶抑制剂对HT的影响作者:夏光涛、张、吴森森、张【摘要】目的:探讨脂氧合酶抑制剂对结肠癌HT29细胞株体外生长抑制和凋亡的影响。

方法:用MTT法绘制生长曲线。

倒置相差显微镜观察细胞形态变化。

扫描电镜观察细胞超微结构变化，检测凋亡小体。

流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期变化。

2、结果:不同浓度NDGA处理后的HT29结肠癌细胞随着药物浓度的增加，形态变圆，体积变小，逐渐从瓶壁脱落，肿瘤细胞凋亡率逐渐增加，癌细胞被阻滞在G0/G1期。

扫描电镜可见凋亡小体的形成。

3、结论:NDGA能抑制结肠癌HT29细胞的生长并诱导其凋亡，且随着药物浓度的增加，凋亡率逐渐增加。

具有剂量依赖效应。

4、【关键词】脂氧合酶抑制剂NDGA诱导结肠癌细胞株HT29凋亡的研究【摘要】目的:从细胞生长抑制、细胞凋亡等方面探讨脂氧合酶抑制剂NDGA(去甲二氢愈创木酸)对结肠癌细胞株HT29的体外作用。

方法:分别应用。

MTT法绘制生长曲线。

5、倒置相差显微镜观察细胞形态学变化，扫描电镜观察细胞超微结构和凋亡小体的变化。

流式细胞仪检测细胞凋亡和周期性变化。

结果:我们用不同浓度的NDGA分别处理癌细胞。

6、随着药物浓度的升高，细胞凋亡率逐渐升高，细胞形态变圆，体积变小，从瓶内表面脱落，扫描电镜可见凋亡小体。

细胞生长阻滞在G0/G1期。

7、结论:NDGA能抑制结肠癌细胞株HT29的生长并诱导其凋亡，凋亡率随药物浓度的增加而增加，并呈现剂量依赖效应。

该药物将细胞阻滞在G0/G1期。

8、【关键词】脂氧合酶抑制剂多彩新脂酶花生四烯酸代谢可分为环氧化酶(COX)和脂氧合酶(LOX)两条途径。

COX是环氧合酶途径的关键酶。

抑制COX活性可以诱导结肠癌细胞凋亡，抑制癌细胞转移。

国内外学者对此已达成共识。

抑制LOX通路能否抑制结肠癌细胞的生长并诱导其凋亡，国内外鲜有报道。

本文用去甲二氢愈创木酸(NordihydroguaiareticAcid，去甲二氢愈创木酸)处理HT29结肠癌细胞株，研究其是否能抑制肿瘤细胞的生长并诱导细胞凋亡，为临床治疗提供依据。

1材料和方法1仪器设备37CO2培养箱(NV2500E美国)、洁净工作台(YJ-1450s，苏州)、倒置相差显微镜(日本奥林巴斯)、普通光学显微镜(日本奥林巴斯BH、台式高速离心机(HERMLEZK、酶联免疫吸附测定(BIORAD、流式细胞仪(FACScan，BD，美国)、JS。

2材料和试剂1结肠癌细胞系HT29细胞系购自山东省医学科学院肿瘤生物治疗中心。

2主要试剂RPMI1640培养基和胰蛋白酶购自Gibco公司。

新生小牛血清购自中国杭州四季青生物工程材料研究所。

NDGA购自Calbiochem公司，四唑盐(MTT)购自适马公司，碘化丙锭(PI)购自北京悦泰生物制品公司。

3细胞培养常规培养HT29结肠癌细胞。

对处于指数生长期的细胞进行实验，用不同浓度的药物处理后，在CO2培养箱中孵育相应的时间，然后检测相关指标。

4细胞形态学观察1倒置显微镜每6小时用高倍显微镜和低倍显微镜观察HT29结肠癌细胞的形态学变化、细胞生长和培养基。

贴墙后，每4小时观察一次。

药物处理后每2小时观察细胞生长和形态学变化。

2扫描电镜观察显示，NDGA(终浓度为100mol/L)作用48h。

取出对照组和给药组有癌细胞的玻片，用3%戊二醛固定，用1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，用1%四氧化锇(四氧化锇)固定1小时，用1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，用乙醇脱水，用乙酸异戊酯代替，在CO2临界点干燥。

5癌细胞凋亡的检测1采用MTT法绘制生长曲线。

实验设计包括5组:空白组(无细胞)、对照组(含PBS溶液)和NDGA组(分别为100mol/L)，每组5个平行孔。

用25%胰蛋白酶消化培养瓶中贴壁的结肠癌HT29细胞。

当细胞形态发生变化时，用含小牛血清的培养基中和细胞，吹制成细胞悬液，以104个/ml的浓度接种到96孔培养板中，每孔200l。

培养24小时后，加入不同浓度的药物，分别培养72小时。

然后，取出培养板以检测细胞的光密度(OD)。

实验方法:每孔加入20l新鲜配制的MTT溶液(5mg/ml)，37继续培养4h。

小心吸取孔中的上清液，向每个孔中加入DMS0150L，放置振荡器10分钟，使晶体完全溶解。

然后，在酶联免疫吸附试验上用双波长(490，570nm)测量光度密度，并将空白组的OD值调至零。

以时间为横轴，OD值为纵轴，绘制生长曲线。

2流式细胞仪检测癌细胞凋亡率和细胞周期变化。

分别收集经NDGA(100mol/L)处理48小时的HT29结肠癌细胞。

用25%胰蛋白酶消化，然后用含小牛血清的培养液中和，然后加入离心管离心，用PBS溶液冲洗，然后离心5分钟(1000r/min)，加入70%冷乙醇固定，4冰箱保存过夜。

用PBS溶液冲洗，用100目筛网过滤，并离心5min(1500转/分钟)加入05mlPI工作液，室温避光30min，电脑上查。

上电脑前用标准荧光微球调整仪器的变异系数，保持在2%以内。

在计算机上采集20XX0个细胞，荧光强度进行对数放大，光散射数据存入软盘。

试验结束后，在Macintosh650计算机上用Modifit软件(由BectonDickinson公司提供)对数据进行分析，并用HP1200c/PS打印结果。

6统计处理定量数据均以xs表示，统计计算用SPSS0统计软件处理，方差分析、t检验、Dunnettt检验等统计处理，p05有统计学意义。

结果1NDGA作用于HT29结肠癌细胞时的形态学观察1对照组HT29结肠癌细胞的倒置显微镜形态学观察为类圆形，部分延伸的癌细胞可呈梭形，贴壁生长。

在NDGA(100mol/L)作用24小时后，细胞开始发生形态变化，表现为细胞变圆变小，细胞内颗粒和空泡增多，细胞粘附力下降，更多的细胞从瓶壁脱落，悬浮在培养基中(图1B)。

随着药物浓度和时间的增加，这种变化越来越明显。

2扫描电镜观察细胞超微结构对照组HT29结肠癌细胞呈贴壁生长，圆形，部分癌细胞伸展成梭形，细胞饱满，表面有丰富的微绒毛。

癌细胞之间连接紧密，表面微绒毛相互交叉。

NDGA(100mol/L)48小时后，癌细胞形成彼此分离的芽状突起。

凋亡小体的形成(图2B)2NDGA诱导HT29结肠癌细胞凋亡1NDG4影响HT29结肠癌细胞的生长曲线。

对照组HT29结肠癌细胞生长迅速，1100mol/LNDGA抑制HT29结肠癌细胞的生长。

各时间段与对照组相比，1mol/L药物治疗组od值呈下降趋势，但与对照组相比无显著性差异。

随着NDGA浓度(10，100mol/L)的增加，OD值与对照组相比有显著差异(P，其中100mol/LNDGA处理组OD值与对照组相比有显著差异(P，表明HT29结肠癌细胞的抑制程度随着药物浓度的增加而增加(见表1和图表1NDGA对结肠癌细胞株HT29od值的影响2HT29结肠癌细胞株凋亡率和细胞周期的变化对照组HT29结肠癌细胞株在G0/G1前出现一个凋亡峰，凋亡率百分比为07。

NDGA(100mol/L)作用48小时后，凋亡峰明显增加，凋亡率百分比为09，与对照组HT29结肠癌细胞株的凋亡率百分比不同。

与对照组相比，S期细胞比例显著降低(P说明NDGA处理后HT29结肠癌细胞凋亡率增加，NDGA可以将HT29结肠癌细胞阻滞在G0/G1期，从而抑制HT29结肠癌细胞的生长(表2，图表2NDGA对HT29细胞凋亡率和细胞周期的影响3论述了花生四烯酸(AA)代谢可以分为环氧化酶(COX)和脂氧合酶(LOX)两条途径。

现已发现，与正常组织相比，睾丸癌、乳腺癌、结肠癌和肺癌组织中LOX的代谢水平明显较高，提示肿瘤的发生可能与花生四烯酸通过LOX途径的代谢有关1，2，3花生四烯酸通过脂肪氧合酶途径进行生化代谢，产生白三烯(LT)和HETE(羟基二十碳四烯酸)。

LOX可分为3个亚型:5LOX、12LOX和15LOX3。

不同类型的肿瘤细胞表达不同的亚型。

本实验选用的NDGA对这三种亚型的酶都有抑制作用。

4国外实验证实结肠癌细胞株HT29具有合成LT的能力，说明该肿瘤细胞中存在LOX的代谢途径，提示该细胞中存在脂肪氧合酶抑制剂位点。

治疗LOX相关肿瘤主要有两种方法。

一种方法是直接应用LT受体拮抗剂。

有学者将SC41930和LTB4拮抗剂应用于结肠癌细胞，可以抑制其生长。

另一种方法是抑制LOX活性。

两者相比，应用LOX抑制剂的作用更直接，可以直接抑制LT的合成，从而诱导肿瘤细胞凋亡，降低其转移能力2将NDGA应用于细胞培养后的HT29结肠癌细胞，研究其诱导凋亡作用的报道较少。

当肿瘤凋亡时，细胞生长周期可以改变。

发现在肿瘤凋亡过程中，肿瘤细胞可以被阻滞在G0/G1期5，6，7，这与本实验结果基本一致。

本实验从细胞形态、超微结构、细胞生长曲线、凋亡率和细胞周期变化等方面证实了NDGA能够抑制HT29结肠癌细胞的生长并诱导其凋亡，且这种作用随着药物浓度的增加而加强，具有剂量依赖性，为LOX的临床应用提供了实验依据。

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