临床医学论文-脂氧合酶抑制剂NDGA对HT.doc

临床论文——脂氧合酶抑制剂对HT的影响作者:夏光涛、张、吴森森、张【摘要】目的:探讨脂氧合酶抑制剂对结肠癌HT29细胞株体外生长抑制和凋亡的影响。 方法:用MTT法绘制生长曲线。倒置相差显微镜观察细胞形态变化。扫描电镜观察细胞超微结构变化，检测凋亡小体。流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期变化。 结果:不同浓度NDGA处理后的HT29结肠癌细胞随着药物浓度的增加，形态变圆，体积变小，逐渐从瓶壁脱落，肿瘤细胞凋亡率逐渐增加，癌细胞被阻滞在G0/G1期。 扫描电镜可见凋亡小体的形成。 结论:NDGA能抑制结肠癌HT29细胞的生长并诱导其凋亡，且随着药物浓度的增加，凋亡率逐渐增加。 具有剂量依赖效应。 【关键词】脂氧合酶抑制剂NDGA诱导结肠癌细胞株HT29凋亡的研究【摘要】目的:从细胞生长抑制、细胞凋亡等方面探讨脂氧合酶抑制剂NDGA(去甲二氢愈创木酸)对结肠癌细胞株HT29的体外作用。方法:分别应用。① MTT法绘制生长曲线。②倒置相差显微镜观察细胞形态学变化，扫描电镜观察细胞超微结构和凋亡小体的变化。③流式细胞仪检测细胞凋亡和周期性变化。结果:我们用不同浓度的NDGA分别处理癌细胞。随着药物浓度的升高，细胞凋亡率逐渐升高，细胞形态变圆，体积变小，从瓶内表面脱落，扫描电镜可见凋亡小体。细胞生长阻滞在G0/G1期。结论:NDGA能抑制结肠癌细胞株HT29的生长并诱导其凋亡，凋亡率随药物浓度的增加而增加，并呈现剂量依赖效应。该药物将细胞阻滞在G0/G1期。【关键词】脂氧合酶抑制剂多彩新脂酶花生四烯酸代谢可分为环氧化酶(COX)和脂氧合酶(LOX)两条途径。 COX是环氧合酶途径的关键酶。 抑制COX活性可以诱导结肠癌细胞凋亡，抑制癌细胞转移。国内外学者对此已达成共识。抑制LOX通路能否抑制结肠癌细胞的生长并诱导其凋亡，国内外鲜有报道。 本文用去甲二氢愈创木酸(Nordihydroguaiaretic Acid，去甲二氢愈创木酸)处理HT29结肠癌细胞株，研究其是否能抑制肿瘤细胞的生长并诱导细胞凋亡，为临床治疗提供依据。 1材料和方法1.1仪器设备37℃CO2培养箱(NV2500E 美国)、洁净工作台(YJ-1450s，苏州)、倒置相差显微镜(日本奥林巴斯)、普通光学显微镜(日本奥林巴斯BH2)、台式高速离心机(HERMLEZK380)、酶联免疫吸附测定(BIORAD450)、流式细胞仪(FACScan，BD，美国)、JS。 1.2材料和试剂1.2.1结肠癌细胞系HT29细胞系购自山东省医学科学院肿瘤生物治疗中心。 1.2.2主要试剂RPMI1640培养基和胰蛋白酶购自Gibco公司。 新生小牛血清购自中国杭州四季青生物工程材料研究所。 NDGA购自Calbiochem公司，四唑盐(MTT)购自适马公司，碘化丙锭(PI)购自北京悦泰生物制品公司。 1.3细胞培养常规培养HT29结肠癌细胞。 对处于指数生长期的细胞进行实验，用不同浓度的药物处理后，在CO2培养箱中孵育相应的时间，然后检测相关指标。 1.4细胞形态学观察1.4.1倒置显微镜每6小时用高倍显微镜和低倍显微镜观察HT29结肠癌细胞的形态学变化、细胞生长和培养基。 贴墙后，每4小时观察一次。 药物处理后每2小时观察细胞生长和形态学变化。 1.4.2扫描电镜观察显示，NDGA(终浓度为100μmol/L)作用48h。 取出对照组和给药组有癌细胞的玻片，用3%戊二醛固定，用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，用1%四氧化锇(四氧化锇)固定1小时，用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，用乙醇脱水，用乙酸异戊酯代替，在CO2临界点干燥。 1.5癌细胞凋亡的检测1.5.1采用MTT法绘制生长曲线。实验设计包括5组:空白组(无细胞)、对照组(含PBS溶液)和NDGA组(分别为1、10、100 μ mol/L)，每组5个平行孔。 用0.25%胰蛋白酶消化培养瓶中贴壁的结肠癌HT29细胞。当细胞形态发生变化时，用含小牛血清的培养基中和细胞，吹制成细胞悬液，以104个/ml的浓度接种到96孔培养板中，每孔200μl。 培养24小时后，加入不同浓度的药物，分别培养24、48、72小时。然后，取出培养板以检测细胞的光密度(OD)。 实验方法:每孔加入20 μ l新鲜配制的MTT溶液(5 mg/ml)，37℃继续培养4h。小心吸取孔中的上清液，向每个孔中加入DMS0150μL，放置振荡器10分钟，使晶体完全溶解。然后，在酶联免疫吸附试验上用双波长(490，570nm)测量光度密度，并将空白组的OD值调至零。 以时间为横轴，OD值为纵轴，绘制生长曲线。 1.5.2流式细胞仪检测癌细胞凋亡率和细胞周期变化。分别收集经NDGA (100μmol/L)处理48小时的HT29结肠癌细胞。 用0.25%胰蛋白酶消化，然后用含小牛血清的培养液中和，然后加入离心管离心，用PBS溶液冲洗，然后离心5分钟(1000 r/min)，加入70%冷乙醇固定，4℃冰箱保存过夜。 用PBS溶液冲洗，用100目筛网过滤，并离心5min(1500转/分钟) 加入0.05ml PI工作液，室温避光30min，电脑上查。 上电脑前用标准荧光微球调整仪器的变异系数，保持在2%以内。 在计算机上采集20000个细胞，荧光强度进行对数放大，光散射数据存入软盘。试验结束后，在Macintosh650计算机上用Modifit软件(由Becton Dickinson公司提供)对数据进行分析，并用HP 1200c/PS打印结果。 1.6统计处理定量数据均以xs表示，统计计算用SPSS12.0统计软件处理，方差分析、t检验、Dunnett t检验等统计处理，p < 0.05有统计学意义。 2.结果2.1 NDGA作用于HT29结肠癌细胞时的形态学观察2.1.1对照组HT29结肠癌细胞的倒置显微镜形态学观察为类圆形，部分延伸的癌细胞可呈梭形，贴壁生长。 在NDGA(100μmol/L)作用24小时后，细胞开始发生形态变化，表现为细胞变圆变小，细胞内颗粒和空泡增多，细胞粘附力下降，更多的细胞从瓶壁脱落，悬浮在培养基中(图1B)。 随着药物浓度和时间的增加，这种变化越来越明显。 2.1.2扫描电镜观察细胞超微结构对照组HT29结肠癌细胞呈贴壁生长，圆形，部分癌细胞伸展成梭形，细胞饱满，表面有丰富的微绒毛。癌细胞之间连接紧密，表面微绒毛相互交叉。NDGA(100 μm ol/L)48小时后，癌细胞形成彼此分离的芽状突起。凋亡小体的形成(图2B) 2.2 NDGA诱导HT29结肠癌细胞凋亡2.2.1 NDG4影响HT29结肠癌细胞的生长曲线。对照组HT29结肠癌细胞生长迅速，1 ~ 100 μ mol/L NDGA抑制HT29结肠癌细胞的生长。 各时间段与对照组相比，1μmol/L药物治疗组od值呈下降趋势，但与对照组相比无显著性差异。 随着NDGA浓度(10，100μmol/L)的增加，OD值与对照组相比有显著差异(P < 0.05)，其中100 μ mol/L NDGA处理组OD值与对照组相比有显著差异(P < 0.01)，表明HT29结肠癌细胞的抑制程度随着药物浓度的增加而增加(见表1和图3) 表1 NDGA对结肠癌细胞株HT29od值的影响2 . 2 . 2 HT29结肠癌细胞株凋亡率和细胞周期的变化对照组HT29结肠癌细胞株在G0/G1前出现一个凋亡峰，凋亡率百分比为1 . 28±1 . 07。NDGA(100μmol/L)作用48小时后，凋亡峰明显增加，凋亡率百分比为10 . 57±3 . 09，与对照组HT29结肠癌细胞株的凋亡率百分比不同。 与对照组相比，S期细胞比例显著降低(P < 0.01)。 而G2/M NDGA治疗组与对照组相比，差异无统计学意义(P > 0.05) 说明NDGA处理后HT29结肠癌细胞凋亡率增加，NDGA可以将HT29结肠癌细胞阻滞在G0/G1期，从而抑制HT29结肠癌细胞的生长(表2，图4)表2 NDGA对HT29细胞凋亡率和细胞周期的影响3论述了花生四烯酸(AA)代谢可以分为环氧化酶(COX)和脂氧合酶(LOX)两条途径。 现已发现，与正常组织相比，睾丸癌、乳腺癌、结肠癌和肺癌组织中LOX的代谢水平明显较高，提示肿瘤的发生可能与花生四烯酸通过LOX途径的代谢有关[1，2，3] 花生四烯酸通过脂肪氧合酶途径进行生化代谢，产生白三烯(LT)和HETE(羟基二十碳四烯酸)。 LOX可分为3个亚型:5LOX、12LOX和15LOX3。不同类型的肿瘤细胞表达不同的亚型。本实验选用的NDGA对这三种亚型的酶都有抑制作用。[4]国外实验证实结肠癌细胞株HT29具有合成LT的能力，说明该肿瘤细胞中存在LOX的代谢途径，提示该细胞中存在脂肪氧合酶抑制剂位点。 治疗LOX相关肿瘤主要有两种方法。一种方法是直接应用LT受体拮抗剂。有学者将SC41930和LTB4拮抗剂应用于结肠癌细胞，可以抑制其生长。 另一种方法是抑制LOX活性。 两者相比，应用LOX抑制剂的作用更直接，可以直接抑制LT的合成，从而诱导肿瘤细胞凋亡，降低其转移能力[2]将NDGA应用于细胞培养后的HT29结肠癌细胞，研究其诱导凋亡作用的报道较少。 当肿瘤凋亡时，细胞生长周期可以改变。 发现在肿瘤凋亡过程中，肿瘤细胞可以被阻滞在G0/G1期[5，6，7]，这与本实验结果基本一致。 本实验从细胞形态、超微结构、细胞生长曲线、凋亡率和细胞周期变化等方面证实了NDGA能够抑制HT29结肠癌细胞的生长并诱导其凋亡，且这种作用随着药物浓度的增加而加强，具有剂量依赖性，为LOX的临床应用提供了实验依据。 考证[1]吉村R，松山M，光桥M，等.脂肪氧合酶与人类实验性癌症的关系[J].国际分子医学杂志，2004，13(3):389393。[2]Vernon E . stelle，Cathy A Holmes，Ernst等.脂肪氧合酶抑制剂作为潜在的癌症化学预防[J].癌症流行病学生物图谱，1999，5 (8): 467483。[3]刘焕涛，孙，，唐.脂氧合酶抑制剂NDGA对乳腺癌MCF7细胞端粒酶和bcl2-2的影响[J].中国现代普通外科进展，2005，8 (6): 358。[4]洪松，Avis I，Vosmd，等.上皮癌细胞系中花生四烯酸代谢酶的表达与选择性生化抑制剂生长效应的关系[J].癌症研究，1999年，59 (9): 22232238。[5]，彭，，吴庆明，等.顺铂对食管癌细胞周期和端粒酶活性的影响[J].胃肠病学和肝病学杂志，2003，12 (2): 181188等。三氧化二砷对慢性粒细胞白血病细胞周期的影响[J].临床血液学杂志，2003，16 (3): 127129。[7]傅，，范平，。三苯氧胺联合阿霉素对乳腺癌MCF7细胞生长和凋亡的影响[J].南京医科大学学报，2003，23