临床医学论文-胰腺组织单细胞悬液制备方法的比较研究.doc

《临床医学论文-胰腺组织单细胞悬液制备方法的比较研究.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《临床医学论文-胰腺组织单细胞悬液制备方法的比较研究.doc（3页珍藏版）》请在万象文库上搜索。

1、临床论文-胰腺组织单细胞悬液制备方法的比较研究作者:张兆辉，李希，夏安洲路，隗洋，陈福兴【关键词】胰腺摘要:目的:寻找更好的胰腺组织单细胞悬液制备方法。

2、方法:以大鼠胰腺冷缺血组织为标本，分别采用剪切法和研磨法制备胰腺组织悬液。

台盼蓝染色法测定细胞存活率，流式细胞仪分析。

结果:剪切法细胞形态较为完整，存活率高。

3、两种方法的APO和变异系数有显著性差异(P结论:剪切法制备胰腺组织单细胞悬液优于研磨法。

4、关键词:单细胞悬液；胰腺；两种胰腺组织单细胞悬液制作方法的流式细胞术比较研究摘要:目的:探讨胰腺组织单细胞悬液制作的机械方法。

方法:所有实验标本均取自冷缺血后大鼠胰腺。

用流式细胞仪检测“切割”和“匀浆”法得到的单细胞悬液。

通过typan蓝排除法评估细胞活力；观察细胞形态学变化。

结果:切割法获得的细胞完整，活力好，APO率和CV值低。

5、结论:用sissors“切割”法制作肾组织单细胞悬液优于“匀浆器”法。

6、关键词:单细胞悬液；胰腺；流式细胞术(FCM)是近年来发展起来的一种新的细胞分析技术，具有快速、准确、高灵敏度和多参数的特点1在这项技术中，细胞的分析和检测都是以单个细胞为基础的，因此单细胞悬液样品的制备是关键环节。

7、样品中细胞数量不足、细胞粘连、杂质碎片过多均可导致分析失败，固体组织中单细胞悬液的制备尤为困难。

8、本实验采用剪切法和研磨法制备新鲜胰腺实性组织单细胞悬液，旨在通过胰腺细胞活力的测定和流式细胞仪分析比较两种方法的优缺点。

材料和方法1试剂和仪器:FACSCalibur流式细胞仪(美国B.D.公司)；XD-101倒置显微镜(江南制造厂)；台盼蓝和碘化丙锭(均为适马公司)2实验标本:10只SD大鼠，雌雄不限，由徐州医学院实验中心提供，按照文献2的方法制备胰腺冷缺血模型。

切取胰腺组织，检测各项指标。

3单细胞悬液的制备:无菌条件下，将胰腺置于平板中，用PBS去除胰腺组织表面的血液和血凝块，从同一大鼠胰腺中取两块大小约5cm3的新鲜组织块，分别切取和研磨制备组织悬液。

1剪切法:将组织块放入平板后，加入少量PBS；用眼剪将组织切成匀浆，加入10mlPBS用吸管吸取组织匀浆，用200目尼龙网过滤到试管中；将沉淀物离心1500prm3min，然后用PBS洗3次，每次以500prm低速短时离心去除细胞碎片，用300目尼龙网过滤细胞团。

计数细胞并将细胞浓度调节至(106个/ml。

常温放置，检测细胞活力。

2匀浆法:用眼剪将组织切成小块；放入70毫升组织研磨机中，加入2毫升PBS；慢慢转动研磨棒，研磨至均匀；用10毫升PBS冲洗研磨机；收集细胞悬液，用300目尼龙网过滤；离心沉淀800prm2min，然后用PBS洗涤3次，离心沉淀。

以下处理与剪切法相同。

4形态学观察和细胞活性测定:取制备好的胰腺细胞悬液，在倒置显微镜下观察其形态学变化；取每组细胞悬液9滴，加入一滴台盼蓝溶液，混匀，然后在4冰箱中静置20分钟，在光学显微镜下用血小板计数板计数活细胞和死细胞。

5荧光染色:取细胞悬液，用70%预冷的乙醇固定过夜，然后用4PBS洗两次。

加入5mlPBS悬浮细胞，再加入50g/ml碘化丙啶染色，4避光染色，过200目尼龙网，流式细胞仪检测。

用CellQuest软件自动获取10，000个细胞/样品，用ModFitLT软件分析DNA含量。

主要检测指标:凋亡水平(APO)、G0/G1细胞比率、DNA指数(DI)、S期细胞比率(SPF)、CV值。

6统计处理:所有数据均以均数标准差表示，差异显著性分析采用配对t检验。

2出菇1细胞形态:倒置显微镜下观察，剪切法获得的胰腺细胞形态完整，分散性好，背景干净，杂质少，而研磨法视野内细胞碎片较多，完整细胞相对较少。

台盼蓝排斥试验检测两种分离方法获得的细胞存活率，剪切法平均为78%，研磨法平均为52%。

2FCM检测结果:从DNA直方图可以看出，匀化法的图形比剪切法差，表现为G1峰明显增宽，在G1峰之前出现一个宽的碎片峰。

DNA含量参数比较(表:两种方法的G0/G1细胞比率、DI和SPF无显著性差异(P，但匀浆法的凋亡水平和CV值显著高于剪切法(P表1不同制备方法对细胞APO、DI、G0/GS、CV值的影响(略)3讨论流式细胞术是近年来发展起来的一种新的细胞分析技术，广泛应用于细胞凋亡等方面的研究，具有快速、准确、高灵敏度、多参数等特点。

然而，单细胞悬液的制备是流式细胞仪分析的关键环节，尤其是在固体组织分散细胞悬液的制备中，仍有许多问题需要解决，至今没有合适的通用方法。

采用哪种方法可以获得产量高、活性高、功能强的单细胞，非常有必要进行进一步的实验研究。

因此，可以根据具体的实验目的和不同的组织特性，选择合适有效的单细胞悬液制备方法。

目前，固体组织细胞悬液的制备方法主要有两种:机械法和酶消化法。

由于胰腺组织中纤维组织较多，实验前期采用了添加纤溶酶和胰蛋白酶的酶消化法，但未获得足够细胞浓度(的单细胞悬液，可能与胰腺腺泡细胞中存在大量消化酶有关。

机械方法主要是给组织更大的压力，使细胞从组织中释放出来。

本实验比较了两种制备胰腺细胞悬液的方法。

显微镜下，剪切法的细胞形态比较完整，背景干净，杂质少，细胞存活率高。

匀浆法制备的细胞悬液DNA直方图质量差，主峰宽，主峰前有许多混沌信号。

根据DNA参数分析，剪切法的凋亡水平和CV值明显低于研磨法，但DI、SPF和G0/G1细胞比率无明显差异。

与剪切法相比，机械法中的研磨法更容易在研磨过程中损伤更多的细胞，容易导致胰腺细胞死亡，完整细胞相对较少，细胞存活率较低。

研磨过程中损伤的细胞和细胞碎片经PI染色后可出现低荧光，显示在凋亡峰位置，出现部分假阳性，导致APO检出率较高。

CV值包括两部分。

一个是标准测得的仪器CV值和实验样品测得的CV值之和。

CV值越小，曲线分布越窄、越集中，测量误差越小。

实验表明，两种方法的CV值有明显差异，剪切法样品的CV值明显低于研磨法。

基于以上分析，我们认为酶消化耗时长，难以获得足够浓度的单细胞悬液。

在机械法中，剪切法不仅比研磨法简单，而且细胞存活率更高，检测精度更好。

因此，剪切法制备胰腺组织细胞悬液优于研磨法。

参考文献:1马文鑫。

流式细胞术技术与原理J.世界医疗器械，1998，4(:28。

2张兆辉，李希，陆葵阳，等.大鼠胰十二指肠移植模型的建立J.徐州医学院学报，20XX，23(:20XX。