临床医学论文-胰腺癌组织中BRAF表达的初步研究.doc

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1、临床医学论文-胰腺癌组织中BRAF表达的初步研究作者：程张军,石欣,卫文俊,汤永辉,高乃荣摘要目的：了解BRAF基因在正常胰腺和胰腺癌组织中的表达水平。

2、方法：6例胰腺癌标本取自胰腺癌手术患者，3例正常胰腺组织取自外伤性胰腺损伤需切除部分胰腺者。

3、用Trizol法抽提每份组织的总RNA，分别进行紫外分光光度计测定、琼脂糖凝胶电泳及Labonchip检测，对总RNA进行质控；应用实时定量PCR技术检测正常胰腺和胰腺癌组织BRAF的mRNA水平；应用Westernblot检测BRAF的蛋白表达水平。

4、结果：BRAFmRNA水平在正常胰腺组织中为.00025，胰腺癌组织中为.00109，上调56倍；Westernblot显示，正常胰腺组织BRAF蛋白表达为50，胰腺癌组织为60，上调17倍。

5、结论：胰腺癌组织中BRAFmRNA和蛋白表达水平均明显上调，其可能的调控机制及生物学效应还有待进一步研究。

6、关键词胰腺癌；BRAF；实时定量聚合酶链反应；WesternblotBRAF(vrafmurinesaraviraloncogenehomologB基因是RAF家族成员之一，能诱导禽原代细胞增殖和NIH3T3细胞分化，是一种癌基因。

7、自Davies等1报道约66%的恶性黑色素瘤和15的结肠癌中BRAF基因存在体细胞错义突变后，该基因与肿瘤关系的研究渐成热点，但其在胰腺癌中的表达尚不清楚。

8、本研究应用实时定量PCR及Westernblot技术检测正常胰腺和胰腺癌组织中BRAF的表达水平，以探讨该基因在胰腺癌发生、发展中可能的作用。

1材料和方法1标本来源与病人签署知情同意书后，收集东南大学附属中大医院20XX年612月胰腺癌手术切除标本7例（C1C7，其中C5号标本降解弃用），所有标本均经病理检查证实为胰腺导管腺癌，其中男性3例,女性3例，年龄5671岁，平均2岁。

临床分期采用1987年国际抗癌协会（UICC）的TNM分期标准，其中期1例、期1例、期2例、期2例。

正常胰腺组织3例(N1N，取自外伤性胰腺损伤需切除部分胰腺者。

手术切除后立即切取标本，快速液氮冷冻，-80保存。

2主要试剂和仪器TrizolRNA提取试剂盒（Sangon公司），逆转录酶Superscript（Invitrogen公司），SybrGreen（Invitrogen公司），InvitrogenRTPCR试剂盒（Invitrogen公司），QIAGENRNeasyKit（QIAGEN公司），Agilent2100Bioanalyzer（Agilent公司），兔抗人BRAF多克隆抗体sc166（SantaCruz公司），羊抗兔抗体（AmershamBiosciences公司）。

3总RNA抽提用Trizol法按操作说明抽提每份正常胰腺及胰腺癌组织总RNA。

采用无RNA酶的DNA酶处理，以提高RNA纯度，并使用QIAGENRNeasyKit进一步纯化总RNA，操作方法按说明进行。

分光光度计测定总RNA的纯度，琼脂糖凝胶电泳初步评价总RNA质量，用Agilent2100分析仪通过Labonchip进一步判定RNA样品的完整性。

不符合质量标准的总RNA弃用，并重新抽提。

4实时定量PCR应用Primerpremier0软件，参照BRAF基因序列设计引物，上游引物为5GGCAGAGTGCCTCAAAAAGAA3，下游引物为5AACCAGCCCGATTCAAGGA3，actin被用作管家基因，上游引物为5GCAGAAGGAAATCACAGCCCT3，下游引物为5GCTGATCCACATCTGCTGGAA3，由上海博亚公司合成。

每份标本取5g总RNA，在逆转录酶Superscript（Invitrogen公司）作用下合成cDNA，加入引物1l、荧光染料SybrGreen5l，总反应体积25l，按InvitrogenRTPCRkit操作说明进行PCR扩增，反应条件：50孵育2min，9510min，接着进行45个循环，9515s，591min。

定量方法采用比较Ct法。

5Westernblot分析200mg组织经研磨粉碎，加入1000l新鲜配制的、冷的蛋白裂解液50mmolL-1TrisHCl,pH5,150mmolL-1NaCl,2mmolL-1EDTA,质量分数为1%的十二烷基磺酸钠(SDS)，每10ml加入1片蛋白酶抑制剂，充分裂解后裂解液经14000rmin-1离心10min，取上清液并测定蛋白浓度。

取40g蛋白与上样缓冲液混合，煮沸5min，置于SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移到PVDF膜，用1BSA封闭。

稀释度11000的sc166于4过夜，加入相应的二抗室温下孵育60min，抗体检查按试剂盒说明书进行。

应用GeneSnap软件（GeneGenomeBioimaging,Syngene公司）进行定量分析。

2结果1总RNA抽提及质量鉴定结果总RNA的OD260/OD280之值在0之间。

琼脂糖凝胶电泳，18s和28s电泳条带清晰，28s和18s亮度之比2（图。

Labonchip检测分析，18s和28s双峰比例及位置均正常，无降解杂峰出现（图，说明总RNA纯度高、无降解、质量好。

正常胰腺组织胰腺癌组织2正常胰腺和胰腺癌组织BRAFmRNA表达水平PCR产物的定量方法采用比较Ct法，即先通过一系列的参数设定分析，得到不同样本相对于待测基因的Ct值（Cyclethreshold，即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数），再根据每个样品的参照基因将目的基因归一化，得到Ct=Ct待测基因Ct管家基因，再转换为起始模板量I=2Ct。

根据以上计算方法获得BRAF基因的起始模板量，从而反映出该基因在不同样本中的表达水平2。

BRAF基因平均模板量(M)在正常组织中为.00025，胰腺癌组织中为.00109（表图，与正常胰腺组织相比，胰腺癌组织中BRAF基因表达上调56倍。

图3正常胰腺和胰腺癌组织中BRAF基因的表达注：I为起始模板量，M为平均模板量3正常胰腺和胰腺癌组织BRAF蛋白表达的水平提取正常胰腺和胰腺癌组织的蛋白作Westernblot分析，比较BRAF的蛋白表达。

结果表明，所有正常胰腺组织只有很弱的BRAF蛋白表达，而胰腺癌组织中则有较强的BRAF蛋白表达。

经过计算机扫描后定量分析，BRAF蛋白表达正常胰腺组织为50，胰腺癌组织为60，上调17倍(图。

图4Westernblot检查BRAF在正常胰腺和胰腺癌组织中的表达3讨论BRAF基因位于染色体7q34，长约190kb，转录mRNA长5kb，编码783氨基酸的蛋白，分子质量为9495kDa3。

在经典的RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK(MEK为mitogen/extracellularsignalregulatedkinase,ERK为extracellularsignalregulatedkinase,MAPK为mitogenactivatedproteinkinase)通路中，BRAF有着重要的作用，是RAS最为关键的效应分子，对MEK/ERK的激活最为重要45。

与其它两种RAF蛋白（ARAF、RAF不同，除神经、睾丸和脾脏外的正常组织中，BRAF表达极低或不表达4，但其MEK激酶活性却显著高于ARAF和RAF1蛋白6。

BRAF激活后能依次磷酸化并激活MEK和ERK，在细胞的不同位置存在多种ERK底物，包括转录因子、核糖体蛋白、酶和细胞骨架蛋白等，持续激活的ERK能影响多种癌的肿瘤标志物78。

因此，维持BRAF基因的正常对维持细胞的正常功能非常重要，一旦该基因表达改变，就会使生物学功能发生紊乱，使其介导的信号通路失调控，最终导致细胞转化甚至恶变。

本研究应用实时定量PCR及Westernblot技术，检测了3例正常胰腺、6例胰腺癌组织中BRAFmRNA和蛋白水平，发现BRAF在胰腺癌组织中的表达明显高于正常胰腺组织。

由于目前对该基因与胰腺癌的相关性研究仍很少，我们推测其表达水平的上调可能由其上游的KRAS或Rap1基因的改变引起，或由其自身的激活性突变或基因扩增所导致，是否存在其他调节机制尚不清楚。

本研究结果提示，BRAF过表达对胰腺癌发生和发展的生物学意义值得进一步研究。

由于样本例数限制，BRAF这种表达差异是否具有统计学意义，以及胰腺癌中BRAF基因表达水平是否与临床病理分期及淋巴结转移有关，尚待进一步探讨。

参考文献1DAVIESH,BIGNELLGR,COXC,etal.MutationsoftheBRAFgeneinhumancancerJ.Nature,20XX,2CHANGJT,CHENIH,LIAOCT,etal.AreversetranscriptionparativerealtimePCRmethodforquantitativedetectionofangiogenicgrowthfactorsinheadandneckcancerpatientsJ.ClinBiochem,20XX,3MEYERP,SERGIC,GARBEC.PolymorphismsoftheBRAFgenepredisposemalestomalignantmelanomaJ.JCarcinog,20XX,4HUSERM,LUCKETTJ,CHILOECHESA,etal.MEKkinaseactivityisnotnecessaryforRaf1functionJ.EMBOJ,20XX,.5MIKULAM,SCHREIBERM,HUSAKZ,etal.Embryoniclethalityandfetalliverapoptosisinmicelackingthecraf1geneJ.EMBOJ,20XX,.6MERCERKE,PRITCHARDCA.Rafproteinsandcancer:BRafisidentifiedasamutationaltargetJ.BiochimBiophysActa,20XX,7PEARSONG,ROBINSONF,BEERSGIBSONT,etal.Mitogenactivatedprotein(MAP)kinasepathways:regulationandphysiologicalfunctionsJ.EndocrRev,20XX,8HANAHAND,WEINBERGRA.ThehallmarksofcancerJ.Cell,20XX,。