临床医学论文-胰岛素样生长因子1和肿瘤坏死因子α对C2C12骨骼成肌细胞增殖和分化的影响.doc

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1、临床医学论文-胰岛素样生长因子1和肿瘤坏死因子对C2C12骨骼成肌细胞增殖和分化的影响【摘要】目的观察胰岛素样生长因子I(IGFI)和肿瘤坏死因子(TNF)对体外培养的C2C12小鼠骨骼成肌细胞增殖、分化的影响。

2、方法体外培养C2C12小鼠骨骼成肌细胞,分别采用IGFI、TNF和IGFI+TNF干预细胞,以MTT法、肌酸激酶(CK)活性测定法检测处理后的细胞在增殖、分化方面的变化。

3、结果IGFI组24,48和72h增殖程度均高于对照组(P，且增殖作用具有时间效应(P。

4、IGFI组和TNF组CK活性均低于对照组(P,但随着时间延长IGFI组CK活性呈升高趋势。

5、结论IGFI促进C2C12骨骼成肌细胞的增殖，延迟其分化；TNF抑制C2C12骨骼成肌细胞的分化。

6、【关键词】胰岛素样生长因子I肿瘤坏死因子恶病质在严重创伤、严重感染、癌症及艾滋病病人中常见。

7、肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)参与恶病质的发生、发展进程,是引起恶病质的主要细胞因子之一;具有抑制骨骼肌细胞蛋白合成,促进蛋白分解作用1。

8、胰岛素样生长因子I(insulinlikegrowthfactorI,IGFI)能促进全身组织细胞的增殖和生长,并具有胰岛素样作用；能抑制细胞凋亡,维持细胞生存,还能保护一些细胞株免受由TNF诱导的凋亡,如胎儿脂肪细胞、大鼠成骨细胞等25。

笔者应用IGFI和TNF处理体外培养的小鼠C2C12骨骼成肌细胞,观察IGFI和TNF对C2C12骨骼成肌细胞增殖和分化的影响。

1材料与方法1材料1细胞株C2C12小鼠骨骼成肌细胞株(中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)。

2试剂和仪器小鼠IGFI、小鼠TNF(英国PeproTechECLTD);胎牛血清、25%胰蛋白酶、PBS(美国HyClone公司);高糖DMEM培养液(美国Gibco公司);噻唑蓝(MTT,英国Biomol公司);二甲基亚砜DMSO(上海化学试剂一厂);肌酸激酶(CK)活性测试盒(南京建成生物工程研究所);752型紫外分光光度计(上海分析仪器总厂);酶标仪(美国Biorad公司);相差倒置显微镜(日本Olympus公司)。

2方法1细胞培养C2C12骨骼成肌细胞株置于含10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培养液,在体积分数为05的CO2培养箱培养。

采用对数生长期细胞进行实验。

2MTT法以浓度0104mL1的细胞悬液接种96孔培养板中,每个实验组种9孔,每孔接种100L,培养12h细胞贴壁后,吸弃培养液,按实验分组加入相应培养液100L继续培养。

在24,48,72h各个时相点的前4h各取培养板1块,每孔加入浓度为5mg/LMTT50L继续培养4h,吸弃上清液后向每孔加入20%DMSO100L,振荡后在酶标仪上以490nm波长测光密度（D）值。

3CK活性测定以浓度0104mL-1的细胞悬液接种25cm0cm的培养瓶,每瓶4mL。

培养12h细胞贴壁后倒弃培养液,按实验分组加入相应培养液4mL继续培养。

在24,48,72h各个时相点以25%胰蛋白酶消化收集各实验组细胞。

用生理盐水(1500r/min,离心10min)洗涤细胞2次,加双蒸水200L,超声处理使细胞破碎,以3000r/min,离心10min后取上清夜。

采用CK测试盒比色法测定D值,根据已知一定浓度标准品的D值计算CK活性。

4实验分组对照组:含2%FBS的DMEM;I组:含2%FBS的DMEM+IGFI100ng/mL;T组:含2%FBS的DMEM+TNF20ng/mL;I+T组:含2%FBS的DMEM+TNF20ng/mL+IGFI100ng/mL。

6统计学处理数据以xs表示。

采用SPSS0统计软件进行方差分析。

P05为差别有统计学意义。

2结果1细胞增殖C2C12细胞在含2%FBS+100ng/mLIGFI培养液培养72h后光镜观察见图1。

24,48,72h检测IGFI和TNF对成肌细胞增殖影响的结果见表1。

细胞核较大,细胞紧密相邻,有方向性,细胞增殖活动旺盛,铺满培养瓶瓶底.2细胞分化24,48,72h检测各组CK活性见表2。

3讨论IGFI是一类广泛存在于机体多种组织中的蛋白多肽,主要由肝脏合成,在体内受生长激素的调节。

它能促进全身组织细胞的增殖和生长,增加细胞生长速度,并具有胰岛素样作用。

IGFI促进细胞的增殖与其具有潜在的有丝分裂原功能有关。

增殖的细胞必须进入细胞周期,IGFI促进细胞增殖作用通过促进细胞从G1期向S期转变6。

本实验证实IGFI可促进C2C12成肌细胞的增殖。

低血清DMEM培养基可以诱导成肌细胞退出细胞增殖循环周期,促进其分化7。

本实验提示,用含2%FBS培养液低血清DMEM培养基可以诱导C2C12骨骼成肌细胞的分化。

通过与低血清的对照组比较,IGFI并无促进C2C12成肌细胞分化的作用。

但随着干预时间的延长,CK值逐渐增高(P,提示IGFI可延迟C2C12细胞的分化。

成肌细胞分化时要离开细胞的增殖周期8,因此认表1不同时相点各实验组测定的吸光度n=I组:含2%FBS的DMEM+胰岛素样生长因子I100ng/mL;T组:含2%FBS的DMEM+肿瘤坏死因子20ng/mL;I+T组:含2%FBS的DMEM+肿瘤坏死因子20ng/mL+胰岛素样生长因子I100ng/mL.与对照组比较,:P05;与组内48h比较,#:P表2不同时相点各实验组测定肌酸激酶值n=I组:含2%FBS的DMEM+胰岛素样生长因子I100ng/mL;T组:含2%FBS的DMEM+肿瘤坏死因子20ng/mL;I+T组:含2%FBS的DMEM+肿瘤坏死因子20ng/mL+胰岛素样生长因子I100ng/mL.对照组比较,:P05;与组内48h比较,#:P05;组间比较,:P为IGFI促进C2C12成肌细胞增殖时,使细胞进入分裂周期,从而抑制了成肌细胞的分化。

进入分化的成肌细胞是不可逆的,最终可导致肌管的形成。

成肌细胞的增殖和分化与骨骼肌的发育和修复关系密切。

TNF是一种由多种免疫细胞、肿瘤细胞等分泌的细胞因子,它在参与各种免疫应答、抗肿瘤、引起恶病质及内毒素性休克等病理生理过程中发挥重要作用。

本实验中,TNF组及IGFI+TNF组的CK值均较同一时相点的对照组低(P,提示TNF抑制C2C12成肌细胞的分化,且这种分化抑制未能被IGFI所拮抗。

Guttridge等研究证明TNF在INF协调作用下,通过抑制核转录因子B(NFB),进而抑制骨骼肌细胞肌浆蛋白bHLH转录因子家族的MyoD蛋白质转录,抑制骨骼肌分化,导致肌肉消耗,当采用NFB的拮抗物IBSR后MyoD被恢复9。

有研究表明,IGFI对受TNF伤害的C2细胞有微弱的改善蛋白代谢作用,其作用结果可能与影响细胞的分化和细胞凋亡有关1。

本实验通过IGFI和TNF对体外培养的C2C12成肌细胞在增殖、分化方面的影响，发现TNF抑制C2C12成肌细胞的分化未能被IGFI所拮抗,且IGFI对C2C12细胞的分化有延迟的作用，笔者认为IGFI改善TNF对C2细胞的蛋白代谢作用可能与其影响细胞凋亡方面关系更为密切，其作用机制仍需进一步实验研究。

【参考文献】1陈思曾,林永堃,吕新生.IGF对TNF伤害的鼠骨骼肌C2细胞蛋白代谢的影响J.福建医科大学学报,20XX,37(:2王敏,黄象艳,李霞,等.胰岛素样生长因子对臂丛神经损伤后骨骼肌细胞凋亡的影响J.中国矫形外科杂志,20XX,11(:.3李银平,黎檀实.胰岛素样生长因子对海水浸泡大鼠肺泡上皮细胞的抗凋亡作用J.中华急诊医学杂志,20XX,13(:4YeP,DErcoleAJ.InsulinlikegrowthfactorIprotectsoligodendrocytesfromtumornecrosisfactoralphainducedinjuryJ.Endocrinology,1999,.5徐萍,张克勤,刘超,等.重组人胰岛素样生长因子对大鼠成骨细胞增殖、凋亡及型胶原蛋白合成的影响J.中国骨质疏松杂志,20XX,12(:6李小川,吕刚,金明熙,等.胰岛素样生长因子抑制人椎间盘细胞凋亡及促进基质代谢的研究J.中华实验外科杂志,20XX,21(:7秦瑞峰,顾晓明,黄富国.流式细胞术测定骨骼肌细胞分化中DNA合成及其细胞周期变化J.第四军医大学学报,20XX,21(:8秦瑞峰,顾晓明,张洁.不同培养条件对骨骼肌细胞增殖及分化的影响J.实用口腔医学杂志,20XX,16(:9GuttridgeDC,MayoMW.NFBinducedlossofMyoDmRNApossibleroleinmuscledecayandcachexiaJ.JSci,20XX,.。