1、 临床论文-脾切除对实验性脑损伤大鼠存活率及血液和脑组织中IL-1含量的影响作者:李梅，吴，张立军，张翔，单友安，林，朱刚，尹志勇，冯华摘要目的观察脾切除后实验性脑损伤大鼠的死亡率、血中IL-1的浓度及损伤面积。 方法成年雄性SD大鼠随机分为A、B、c三组。 采用Feeney自由落体法损伤大鼠右侧顶叶，观察各组大鼠伤后7天内的死亡率(nA=23，nB=65，nC=65)。采用ELISA法测定大鼠伤后6、12、24小时、2天、3天血中IL-1浓度(各时间点nA=nB=nC=6)。定量PCR检测伤后6、12、24小时、2、3天损伤区脑组织中IL-1mRNA的含量(各时间点nA=nB=nC=3)。
2、结果伤后7d内，A、B、C组死亡率分别为0%、38.46%和16.92%，各组间差异有显著性(P 结论大鼠脑外伤后脾切除可显著降低大鼠死亡率，并在一定程度上抑制创伤区血液和脑组织中IL-1的产生。 【关键词】颅脑损伤；脾切除术；死亡率；白介素1；大鼠摘要:目的观察脾对实验性脑外伤大鼠死亡率、血中il1 浓度及其mrna含量的影响，为重型颅脑损伤患者提供有效的临床治疗。方法成年雄性SD大鼠随机分为3组:脑脾假手术组(A组)、实验性脑损伤脾假手术组(B组)和实验性脑损伤脾切除组(C组)。采用改良的费尼氏法建立实验性脑外伤动物模型。计算实验后7天内的死亡率(nA=23，nB=65，nC=65)，EL
3、ISA法检测实验后6、12、24小时、2、3天的血中IL-1浓度(nA = nB = nC = 6)；还测定了IL-1mRNA的荧光定量。结果A、B、C组实验后7d内死亡率分别为0%、38.46%和16.92%(P 继发性脑水肿是患者死亡的关键原因之一，白细胞介素1 (IL 1)等多种促炎因子的释放与继发性脑水肿密切相关2 脾脏是人体最大的免疫器官，在应激状态下可释放多种炎症介质，在炎症反应中发挥重要作用。但有研究表明，炎症因子的释放可加重颅脑损伤的程度3 本实验旨在明确脾切除对颅脑外伤后实验大鼠死亡率的影响，探讨脾切除后血中IL-1浓度和脑组织中IL-1 mRNA含量的变化，并初步阐明其机制
4、。 材料与方法1材料清洁健康成年雄性SD大鼠(200 250 g，2 3月龄，购自第三军医大学大坪医院动物中心) 室温25，相对湿度70%，昼夜光照12h/12h；大鼠白细胞介素1 (IL 1 ) ELISA试剂盒(上海西塘，96孔板)，酶标测试仪(BIO RAD，550型)；DEPC(罗氏公司)、Tris碱基(北京鼎果)、氯仿(成都科龙化学试剂厂)、异丙醇(成都科龙化学试剂厂)、RT-PCR试剂盒(东洋博公司)、2Taq PCR Master Mix(北京天根公司)、50bp标志物(后台天根公司)；GAPDH引物(上海龚升生物工程有限公司合成)、低温离心机(适马公司)、荧光定量PCR仪(AB
5、I 7500)、分析软件PCR system 9700(应用生物系统公司) 方法22.1实验动物组SD大鼠随机分为三组:A组、B组、c组。 实验前禁食8小时，不喝水；在观察大鼠伤后死亡率的实验中，A组:n=23，B组:n=65，C组:n = 65；采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组大鼠伤后6、12、24小时、2、3天血清中IL-1的浓度。采用实时定量PCR检测伤后6、12、24小时、2、3天伤侧脑组织中IL-1 mRNA的表达，每组大鼠在每个时间点均为3只。 2.2颅脑损伤动物模型的制备:按照Feeney方法建立大鼠实验性重型颅脑损伤模型4 1%戊巴比妥钠40mg/kg用于肌肉麻醉，颅骨
6、顶部脱毛消毒。将大鼠固定在立体定向仪上，经正中切口开颅，用牙钻在冠状缝后方3mm与矢状缝右侧3mm的交叉处钻孔，将骨窗扩大至6 mm和6 mm(从前方至冠状缝，左侧缘矢状缝右侧2mm)，以保持硬脑膜完整。将重30g(打击端直径4.5mm)的圆柱形打击杆沿垂直固定在立体定向仪上的套管从20cm的高度释放，打击中心为钻孔点；用明胶海绵局部止血，间断缝合头皮，直至无活动性出血。 对照组(A组)只开骨窗，不打击。 脾脏的处理:将大鼠仰卧位固定在手术台上，左腹部消毒，铺上毛巾，在左侧肋缘下端中点作一长约2.5cm的切口，逐层打开腹腔，轻轻提起脾脏，结扎脾脏血管，取出脾脏。 A、B组大鼠只需轻轻将脾脏提离
7、腹腔，再放回腹腔。 层层缝合肌肉和皮肤。 2.3 ELISA法测定伤后不同时间大鼠血中IL-1浓度2.3.1材料:麻醉大鼠，开胸，心脏取血。血液静置30分钟后，12000g离心10分钟，取上清液，保存于-20检测。 2 . 3 . 2 IL-1浓度检测:根据IL-1ELISA检测试剂盒说明书，在酶标仪上测定450nm处的吸光度，根据标准浓度建立标准曲线，计算样品中IL-1的浓度。 2.4荧光定量PCR法测定损伤脑组织中IL-1 mRNA表达2.4.1材料:将大鼠断头处死，完全切除损伤大脑半球，洗涤血块，修剪组织仅保留损伤边缘2mm将组织保存在液氮中。 2.4.2荧光定量实时PCR:总RNA提取
8、及鉴定:将约30 50 mg脑组织在液氮中研磨成粉末，酚氯仿法提取总RNA；用紫外分光光度计检测提取的总RNA的质量和浓度，所有RNA样品的A260/A280在1.7 2.0范围内。 逆转录(RT)cDNA的合成:根据东洋纺公司的逆转录试剂盒，逆转录(20 l系统)包括:5RT缓冲液4.0l，RNA Ace 0.5l，RNA酶抑制剂0.5l，dNTPs 2.0l，Oligo(dT) 1.0l。 反应条件:(20l体系置于PCR仪中反应)4210分钟3020分钟995分钟45分钟。 定量实时PCR:IL-1和GAPDH(内标)引物由上海龚升合成。 IL-1引物序列:F5 CGTGGCacattg
9、gtcaa3，r5 ctgtgacc cctt gatc 3；GADPH引物序列:f5acccatcaccattccaggag3，r5agaaggggcggagatgatgac3总反应体系为20l，包括:cDNA 2.0l，GAPDH 1 0.5 l，GAPDH 2 0.5 l，2Mix Taq 10.0 l和H2O 7.0 l 反应条件的设定:(1)预热:94，5分钟，一个循环；(2)扩增:9430秒；5030秒，7230秒；共35个周期；(3)退火:72，10分钟 将15l PCR产物在1%琼脂糖凝胶中以5v/cm电泳，用图像采集和分析软件PCR System 9700分析电泳条带。IL-
10、1的表达以条带校正体积与GAPDH校正体积之差的对数值表示，其中6小时时相点的A组样本作为对照。 3统计处理实验数据用SPSS 11.5软件处理，各组数据用均数标准差(S)表示。多组样本间的均数比较采用单因素方差分析，P 结果1观察各组大鼠伤后早期死亡率。B组和C组大鼠伤后均有不同程度的神经功能障碍，如精神差、食少、活动少、左侧肢体瘫痪、颈部支撑头部困难、头部向左转、夹尾刺激后逆时针旋转等。a组大鼠无神经功能障碍，观察到B组和C组大鼠的死亡均发生在伤后7天内，7天后死亡的很少见，故各组大鼠死亡率均按伤后7天计算(见表1)。 表1各组大鼠伤后7天内死亡率统计2各组大鼠伤后不同时间点血中IL-1浓
11、度测定。A组和C组大鼠血中IL-1浓度先逐渐升高，伤后24小时达高峰，然后逐渐下降，伤后3天达到伤后6小时的水平。而B组大鼠血液中IL-1浓度逐渐升高，伤后3天达到1200pg/ml，与其他组相比有统计学意义(图1)。 与a组相比:*P 结果表明，B组和C组大鼠伤侧脑组织中IL-1mRNA的含量从伤后6h开始急剧升高，C组在伤后早期明显高于B组。之后均有所下降，但C组下降幅度明显大于B组(图2) 发现脾脏可通过释放炎症介质促进炎症因子的级联反应，加重继发性损伤程度，尤其是脾脏在急性胰腺炎病理过程中的作用5，6，目前尚无其在重型颅脑外伤中作用的相关报道。 因此，我们对实验性脑外伤大鼠进行脾切除，
12、观察其对大鼠存活率的影响，以及对伤侧血液和脑组织中重要炎症介质IL-1含量的影响，以探讨脾切除对脑外伤大鼠的作用及可能机制。 实验结果表明，脾切除可使脑外伤实验大鼠伤后7天死亡率由38.46%降至16.92%，两者有显著差异。首次发现伤后脾切除对脑外伤大鼠有积极的保护作用。 为了尽可能排除其他因素的干扰，本实验选用健康清洁的SD大鼠，排除雌激素脑保护的干扰7。老鼠的年龄和体重基本相同，随机分组，喂食的地方温度和湿度都一样。 实验结果提示脾脏参与并加重了颅脑外伤后的病理过程。而颜等人6对急性胰腺炎大鼠进行研究，发现正常大鼠胰腺的病理改变明显重于既往脾切除大鼠，证明脾脏对急性胰腺炎的发展有一定影响
13、，脾切除可减轻或阻止其病程的发展。也说明脾脏可能加重应激后的病理反应程度。 研究表明，脑损伤后IL-1、IL-6、TNF-等多种细胞因子显著升高8-11，参与了脑损伤后的病理过程，其中IL-1的作用相对显著。 正常情况下，中枢神经系统只表达少量的IL-1及其受体，创伤后IL-1的表达显著增加，与继发性脑水肿的形成密切相关。 朱刚等12发现，脑外伤后伤侧脑组织中IL-1随着脑水肿的形成而显著升高，应用IL-1特异性抗体可明显抑制脑外伤后脑水肿的发生。劳埃德等人13也得出了同样的结论。 结果表明，C组大鼠脾切除后血液中IL-1的变化趋势与假手术对照组基本一致，除伤后6h显著低于对照组(A组)外，其
14、余时间点二者无显著差异。而B组大鼠血中IL-1含量呈逐渐升高趋势，伤后第2、3天显著高于A、B组，表明创伤性脑损伤后脾脏可释放IL-1，参与炎症反应过程。但创面血脑屏障的损伤也使IL-1到达脑组织的损伤部位，可能进一步加重脑组织的炎症反应。 实时定量PCR结果显示，在伤后早期，B组和C组大鼠损伤局部脑组织中IL-1mRNA的含量均显著升高，且C组明显高于B组。之后均呈下降趋势，但C组下降速度较B组更明显，至伤后3天与A组基本持平。但B组下降速度较慢，伤后3天仍明显高于A组。 Harting等8利用大鼠皮质损伤模型研究了伤后6、12、24、48、72h损伤区脑脊液，发现伤后早期IL-1等细胞因子
15、含量显著升高，与我们的研究结果一致。 结合血液中IL-1含量的ELISA实验结果，我们推测损伤区脑组织中的IL-1主要是在伤后早期由局部炎症细胞活化产生的，但IL-1的量会逐渐减少，然后脾脏会参与脑损伤后的病理过程，伤后2天左右血液中的IL-1等炎症因子会显著升高。这些炎症因子会通过血脑屏障到达损伤区的脑组织并参与局部炎症反应，加重继发性脑水肿的程度，最终在脾切除后，这种影响被消除，死亡率明显降低。 综上所述，脾切除可显著降低脑外伤大鼠的死亡率，并对血中IL-1有一定的抑制作用。但在未行脾切除的创伤性脑损伤大鼠中，脾脏通过过度分泌IL-1加重炎症反应，可能是加重病情、增加死亡率的重要机制。 脾
16、切除对创伤性脑损伤大鼠保护作用的具体机制有待进一步研究和证实，从而为重型创伤性脑损伤患者的临床治疗提供新的思路和途径。 1Myburgh JA，Cooper DJ，Finfer SR，等.澳大利亚和新西兰创伤性脑损伤的流行病学和12个月预后J.创伤杂志，2008年，第64卷第4期，第854-862页。2卡希姆HJ，杜查托J，塞比里等.细胞因子与脑损伤:邀请综述J.重症监护医学杂志，2008，23(4):236-249。3Hurn PD，Subramanian S，Parker SM，等.实验性卒中的T和B细胞缺陷小鼠的病灶大小和炎症反应均有所减少J.脑血流代谢杂志，2007，27(11):17
17、98-1805。4Feeney DM，Boyeson MG，Linn RT，等。对皮质研究的反应:大鼠并发症的方法学和局部效应j.大脑研究，1981年，211 (1): 67-77页。5陈占峰，陈琦龙。核因子B在急性胰腺炎大鼠脾脏中表达的意义J.中华普通外科杂志，2008，17 (3): 233-236。6阎，程宇，罗剑飞，等.脾脏在急性胰腺炎中作用的实验研究J.北京:中医药大学学报.中华肝胆外科杂志，2005，11 Dela Cruz CD，等.卵巢切除术后雌激素治疗的时机决定其神经保护和抗炎作用的有效性J.美国国家科学院学报，2007，104(14): 6013-6018。8Harting
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