1、 临床论文-脑肿瘤干细胞起源的研究进展及意义【摘要】脑肿瘤干细胞的分离培养已经成功，但其起源细胞是什么、起源机制尚不清楚。 本文在简要介绍脑肿瘤干细胞发现过程的基础上，综述了其来源的研究进展，并初步探讨了发现脑肿瘤干细胞的临床意义。 【关键词】脑肿瘤，脑肿瘤干细胞，神经干细胞，脑肿瘤是神经外科最常见的疾病之一，尤其是胶质瘤，具有发病率高，恶性度高，发展迅速，复发率极高的特点。 虽然围绕脑肿瘤的治疗手段有手术、放疗、化疗、免疫治疗等，但长期以来，脑肿瘤患者的生存率并没有明显提高，根本原因是无法彻底清除肿瘤细胞。 近年来发现肿瘤组织中存在能自我更新和增殖的细胞。这些细胞在肿瘤发生、发展、侵袭、转移
2、和耐药的生物学特性中起主要作用，称为肿瘤干细胞(tumor stem cells，TSC)。正是肿瘤干细胞的存在，使得肿瘤一旦不能完全切除，很容易复发。 脑肿瘤中也存在肿瘤干细胞1，因此脑肿瘤的治疗必须以消除脑肿瘤干细胞为目标。但目前对脑肿瘤干细胞的来源和机制知之甚少，如何发现并有效杀伤脑肿瘤干细胞仍在研究中。 1脑肿瘤干细胞的发现Singh等人1首先提出了脑肿瘤干细胞(BTSCs)。他们利用神经干细胞(NSCs)的技术分离出各种类型的神经胶质瘤细胞，然后在无血清神经干细胞培养基中培养这些肿瘤细胞。结果发现只有表达神经干细胞标志物nestin和CD13的肿瘤细胞才能生长成瘤球，瘤球形状与神经干
3、细胞球相似，其他细胞贴壁不形成瘤球。 将这些瘤球分离出来制成细胞悬液，然后在96孔板中进行有限稀释培养(最小密度为1个细胞/孔)。所有由瘤球制成的细胞悬液再次形成瘤球，在形态和细胞组成上与原瘤球无差异。如果对这些肿瘤球进行传代培养，肿瘤球的体积会不断增大。这些现象表明表达nestin+和CD133+的细胞具有自我更新和增殖的能力。 为了证明这些nestin+和CD133+肿瘤细胞不是污染的神经干细胞，Singh等人在一定条件下诱导了这些细胞的分化。结果，分化后的肿瘤细胞群在细胞组成和细胞比例上与原肿瘤接近，但与神经干细胞的分化结果不一致:神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞各占一定比例。 此外，
4、他们还检测到这些nestin+和CD133+细胞有10号和16号染色体缺失，18号染色体增加。 因此，他们得出结论:胶质瘤中存在少数具有干细胞特征的肿瘤细胞，这些肿瘤细胞具有自我更新、无限增殖和多向分化的能力，胶质瘤的各种细胞成分都是由这些具有干细胞特征的肿瘤细胞分化而来，可称为BTSCs。 他们进一步将从髓母细胞瘤分离的CD133+和CD133-细胞植入NOD/SCID小鼠。结果，只有100个CD133+细胞才能在小鼠体内形成肿瘤，而50 000 100 000个CD133-细胞仍然不能引起肿瘤2，这为BTSCs的存在提供了更有力的证据。 2.探索BTSCs的起源细胞BTSCs的发现为脑肿瘤
5、的诊断和治疗提供了新的思路，脑肿瘤诊断和治疗的核心将集中在如何发现和杀死BTS CS上。 然而，还没有确定BTSCs的起源细胞。BTSCs是脑瘤的原因还是脑瘤发展的结果还有待进一步探讨。 因此，BTSCs的起源成为脑瘤研究的焦点，目前已提出多种假说。 2.1 BTSCs来自NSC 2.1.1学者观点Hanahan等人3认为，单个细胞经过4 7次突变后可能发生恶性转化，组织更新越快，复制和转录过程中基因突变的概率越高。 神经干细胞是中枢神经系统中最活跃的细胞。它们长期处于分裂增殖状态，容易发生突变。因此，突变的神经干细胞有可能转化为干细胞。 Shiras等人4在体外连续传代培养神经干细胞系HNG
6、C-1。经过多次传代培养，部分细胞转化增殖速度快于HNGC-1细胞，具有干细胞自我更新和无限增殖的特性。 Shiras等人将其命名为HNGC-2，然后测试这两种细胞系的致瘤性。他们分别给裸鼠注射了107个HNGC-1和HNGC-2细胞。结果，注射的HNGC-1细胞没有形成肿瘤，但注射的HNGC-2细胞形成了更大的分叶状肿瘤。 为了进一步分析HNGC-1和HNGC-2在大脑中形成肿瘤的可能性，他们将107个HNGC-1细胞注射到裸鼠的颅骨中。结果，两个月后，颅骨没有发现肿瘤。免疫组织化学也证实大脑中没有肿瘤细胞。但将1000个HNGC-2细胞注入裸鼠颅骨，6 8天后形成肿瘤。组织切片显示肿瘤具有
7、恶性胶质瘤的特征。 Shiras等人的实验是NSC可以转化为BTSCs的最有力证据。 2 . 1 . 2 BTS cs与NSC在生物学特性上有许多相似之处，表现在以下几个方面:(1)体外培养 BTS和NSCs一样，在无血清培养基中保持未分化状态，加入bFGF和EGF后，形成悬浮的球形结构，但在有小牛血清的培养基中会分化。 (2)自我更新和增殖能力 将亲代肿瘤球制成单细胞悬液，然后在96孔板中有限稀释培养。结果所有悬液再次形成瘤球，与原来的瘤球完全一致，说明BTSCs和NSC一样，具有很强的自我更新能力。 (3)定向分化 已经证明NSCs可以分化为神经元和神经胶质细胞，实验也证明接种在重度联合免
8、疫缺陷(SCID)小鼠体内的BTSCs形成的肿瘤包含了亲代肿瘤中的各种细胞成分。 Singh等2将小鼠脑内接种BTSCs获得的瘤块与母瘤进行比较，发现接种髓母细胞瘤干细胞后，肿瘤细胞小而圆，细胞核深染。多形性胶质母细胞瘤干细胞接种后，肿瘤细胞呈多形性，肿瘤血管丰富，与母瘤一致。 NSC可以区分脑组织成分，BTSCs可以区分脑肿瘤成分，提示BTSCs和NSC可能是同源的。 (4)NSC和BTSCs都具有较高的端粒酶活性。 以往的研究表明，在端粒酶的催化下，延长的DNA端粒是细胞能够长期存活和增殖的原因。 NSC本身具有较高的端粒酶活性，很可能在微小的基因改变后，NSC失去增殖控制，成为BTSCs
9、。 这些生物学上的相似性表明，与分化细胞相比，NSCs只有通过突变才能成为BTSCs，从而获得过度增殖能力。 2.1.3研究结果正常情况下，干细胞更新是受到严格控制的，更新后，相关的信号转导通路会被关闭。如果持续刺激，这些通路会保持活跃，干细胞会处于不断分裂更新的状态，基因突变的概率也会相应增加。 随着突变的积累，干细胞将进化为能够自我激活这些信号转导通路的肿瘤干细胞5，6 在研究NSC和BTSCs时，发现它们共有几个调节细胞增殖的信号转导通路:(1)Sonic hedgehog(shh)通路；(2)Wnt通路；(3)Bmi-1通路；(4)在神经干细胞自我更新的分化过程中，一个名叫PTEN的肿
10、瘤抑制基因起着重要作用。最近的研究7表明，该基因的改变是BTSCs的关键事件。 这些通路的存在表明NSC和BTSCs之间存在特殊的起源关系，很可能是一个品系。然而，从NSC到BTSCs调控的关键分子事件我们仍然不知道。 2.1.4干扰NSC基因可诱发脑肿瘤形成Knoepfler等8发现，干扰小脑外颗粒层干细胞中的Sonic hedgehog(shh)通路可诱发髓母细胞瘤；戴等9将Ras和Akt基因导入神经前体细胞和星形胶质细胞，发现只有转入神经前体细胞才能发生肿瘤。 实验表明，转染了癌基因的神经干细胞在小鼠体内生长出脑肿瘤，但在脑肿瘤中找不到NSCs 10，因此推测这些转染的NSCs成为BTS
11、Cs。 2.1.5 NSC本身具有分化成多种细胞谱系的能力。在一些胶质瘤中，如多形性胶质母细胞瘤、神经节细胞胶质瘤和胶质肉瘤，有许多肿瘤细胞谱系，如神经节细胞胶质瘤，除了肿瘤性神经元外，还有许多肿瘤性星形胶质细胞。胶质肉瘤中，除了肿瘤性胶质细胞外，还有肉瘤细胞，很难用单个细胞的起源来解释。这些不同谱系的细胞可能各自来源于同名的分化细胞，但更有可能是由NSC突变转化的BTSCs分化而来，因为NSC本身具有分化为多种细胞谱系的能力。 2.2 BTSCs来源于突变分化的脑组织细胞，如神经元或胶质细胞2.2.1形态学基础早在20世纪20年代，Bailey在显微镜下观察脑肿瘤细胞，发现星形细胞瘤细胞像星
12、形胶质细胞，少突胶质细胞瘤细胞像少突胶质细胞，高度恶性胶质母细胞瘤细胞像低分化前体细胞。 现在的显微电子显微镜和免疫组织化学技术也证实了这一点。 迄今为止，肿瘤的病理诊断仍是通过观察肿瘤细胞与正常组织细胞的形态相似性来确定其来源。 2.2.2基因水平根据Uhrbom等人11的研究发现，分化的星形胶质细胞在缺失肿瘤抑制位点INK4a-ARF后可去分化为神经前体细胞，在致癌因子的作用下易发生恶性转化和神经母细胞瘤。 此外，Tchougounova等人12发现，小鼠INK4a-ARF基因座缺失后，星形胶质细胞源性肿瘤的概率显著增加。 这些实验表明，分化后的脑组织细胞发生了遗传变化，可以产生脑肿瘤，间
13、接表明它们可以转化为BTSCs。 根据DNA的半保守复制理论，DNA在复制过程中的碱基配对错误首先发生在新的合成链上而不是模板链上13。NSCs分裂时，模板链始终留在新生成的NSCs中，而碱基错配的新链则被传递到神经元或胶质细胞中，直到这两个细胞分化、老化、死亡后被清除。 NSC的这种分裂特性是为了防止基因突变在NSC中积累，但却使得分化细胞中存在突变的概率高于NSC。如果一次错配的碱基多了，这些神经元或胶质细胞就可能去分化，转化为BTS细胞。 3寻找BTSCs来源的临床意义在BTSCs被发现后，大多数学者支持脑肿瘤的形成、存在和生长是由BTSCs决定的观点。因此，从BTSCs研究脑肿瘤的起源
14、细胞、分子病因学、侵袭和扩散以及耐药性是关键。然而，在btsc的起源问题解决之前，对这些问题的研究是有限的，因此弄清btsc的来源具有重要意义。 3.1脑肿瘤病因学的研究对象转移过去对肿瘤的研究是以肿瘤细胞为对象的。通过观察肿瘤细胞的遗传变化特征以及与遗传、环境等危险因素的相关程度，推断肿瘤的病因。 在明确了BTSCs起源的细胞后，对脑肿瘤病因学的研究将集中在BTSCs起源的细胞上14，从而从起源上探索脑肿瘤发生发展的规律，为更好的预防和治疗脑肿瘤提供有力的依据。 3.2研究BTS-cs来源细胞向BTS-cs转化过程中出现的特异性标志物，为脑肿瘤的预防和早期发现提供依据。此外，脑肿瘤的病理类型
15、和恶性程度与BTS-cs有关，BTS-cs的表型必然与其来源细胞有关。因此，脑肿瘤的病理诊断不会仅由肿瘤细胞的表型决定，而是由BTS-cs及其来源细胞决定。 3.3弄清BTS起源细胞的功能，不仅是对BTS理论最有力的支持，目前仍未得到充分证明，而且可以很好地解释一些关于脑肿瘤生长规律和形态特征的问题，如:胶质瘤呈浸润性，恶性程度高，一般不侵犯颅骨，而脑膜瘤多为球形，恶性程度低，但易侵犯颅骨；I级胶质瘤患者的10年生存率可达100%，而IV级胶质瘤患者的10年生存率徘徊在1年左右15。此外，大多数脑肿瘤具有单一细胞谱系，但在多形性胶质母细胞瘤、神经节细胞瘤和胶质肉瘤中有许多细胞谱系。 脑肿瘤的这
16、些现象必然与BTSCs及其来源细胞的生物学特性有关。因此，只有了解BTSCs的起源过程，才能很好地解释它。 3.4 BTSCs提出后，脑肿瘤的治疗必须集中在如何杀死BTSCs上16阐明BTS CS的来源和机制将对未来制定脑肿瘤的治疗策略起到至关重要的作用。 它可以在基因水平、蛋白质水平和细胞水平干预BTSCs及其起源细胞，预防、逆转和杀伤脑肿瘤。 比如借助起源细胞信号转导的研究成果，可以帮助寻找BTSCs的信号转导靶点，诱导肿瘤干细胞凋亡，阻止肿瘤干细胞分化。 3.5 BTS cs的来源关系到NSC移植的安全性。如果BTSCs来源于NSC，那么NSC移植无疑是危险的。需要阐明NSC向BTS C
17、S转化的机制，调控移植NSC的分化，防止移植NSC恶性转化。 如果BTSCs的来源与NSC无关，推广应用NSC是安全的。 4展望目前对BTSCs的研究，主要是如何分离和鉴定BTSCs。BTSCs的起源只是推测，在NSC起源理论或分化细胞起源理论中都没有直接证据。 在寻找BTSCs的道路上还有许多困难需要解决:目前还没有找到BTSCs的特异性标记；BTS、NSC和分化脑细胞有什么本质的遗传差异？基因突变目前被认为是BTSCs形成最可能的原因，但最关键的基因突变是什么？他们的表情产品是如何运作的？没有办法使单个NSC或分化的脑组织细胞发生恶性转化，并检测出转化的细胞是BTSCs。 BTS在脑肿瘤的
18、病因学、病理学、诊断学、治疗学等方面具有重要的潜在意义。，对其起源的研究将投入越来越多的资金。随着高密度基因芯片、差异PCR、大规模DNA测序、蛋白质双向凝胶电泳等技术的发展，将发现正常脑细胞、NSC和BTSCs之间的关键基因差异和表达差异，进而揭开BTSCs起源之谜。 参考文献 1辛格SK，兰，瑞光T，等.人脑肿瘤中一种肿瘤干细胞的鉴定.癌症研究，2003年，63: 5821-5828.2。人脑肿瘤起始细胞的鉴定。自然, 2004，432:396-401.3。癌症的特征。Cell，2000，100:57-70.4 Shiras A，Chettiar ST，Shepal V，等.在人类gli母
19、细胞瘤模型中，人类成人非致瘤干细胞向癌症干细胞的自发转化是由基因组不稳定性驱动的。干细胞，2007，25:1478-1489.5。癌变过程中的组织修复和干细胞更新。Nature，2004，432:324-331.6 Liu BY，McDermott SP，Khwaja SS等. Wnt效应物的转化活性与其诱导乳腺祖细胞积累的能力相关。美国国家科学院院刊，2004，101(12):4158-4163.7 Tunici P，Bissola L，Lualdi E，等.成人胶质母细胞瘤来源的神经球的遗传改变和体内致瘤性。分子癌症，2004，3:25.8。音速下的神经前驱循环:N-Myc踏板，GSK-3
20、刹车。细胞周期杂志，2006，5(1):47-52.9戴春，刘士满，施亚，等。星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤的特征是由两种不同的和可互换的信号形式引起的。瘤形成，2005，7(4):397-406.10 Karen SA，Alice B，Nikolai BR，等.神经干细胞在成人脑中表现出广泛的病理学趋向性:来自颅内神经胶质瘤的证据.美国国家科学院院刊，2000，97(23):12846-12851.11 Uhrbom L，Kastemar M，Johansson FK等.在kras诱导的小鼠胶质细胞瘤形成中ink4a和Arf对细胞类型特异性肿瘤的抑制作用.癌症研究，2005，65:2065-20
21、69.12 Tchougounova E，Kastemar M，Bra ster D，等. Arf的缺失导致PDGFB诱导的少突胶质细胞瘤的肿瘤进展.癌基因，2007，26(43):6289-6296.13 Potten CS，Owen G，Booth D .肠干细胞通过选择性分离模板DNA链来保护其基因组。j细胞科学杂志，2002，115(11):2381-2388.14被膜P，Irvin D，刘G，等.脑肿瘤干细胞:临床治疗的新靶点？神经外科聚焦，2006，20 (4): E27.15费洲，张翔，甄海宁。加强胶质瘤分子病理机制的研究。中华神经外科杂志，2006，5 (2): 97-98.16 Galderisu，Cipollaro M，Giordano A .干细胞与脑癌。细胞死亡与分化，2006，13:5-11。
鄂公网安备 42010502001450号
