临床医学论文-脑损伤大鼠胫骨骨痂中降钙素基因相关肽的改变.doc

1、临床医学论文-脑损伤大鼠胫骨骨痂中降钙素基因相关肽的改变【摘要】 目的 研究脑损伤后大鼠胫骨骨痂中降钙素基因相关肽(CGRP)的变化及骨痂量的改变。方法 将100只雄性Wistar大鼠随机分为两组，脑损伤加右胫骨骨折组和单纯右胫骨骨折组各50只。术后3、7、14、21、28 d分批处死，检查血清碱性磷酸酶，摄右胫骨X线片测量骨痂面积，骨痂行苏木精2伊红(HE)染色和降钙素基因相关肽免疫组织化学染色。结果 脑损伤加骨折组较单纯骨折组术后3、7 d，碱性磷酸酶均显著升高(P0.01)；脑损伤加骨折组较单纯骨折组术后14、21 d，骨痂X线面积大；脑损伤组早期形成大量纤维骨痂和软骨骨痂，骨痂中降钙素

2、基因相关肽免疫阳性神经纤维多，明显增厚的骨膜内层骨祖细胞、幼稚的软骨细胞胞浆内降钙素基因相关肽强阳性表达；骨折愈合快，降钙素基因相关肽表达明显增强。结论 脑损伤后骨痂中降钙素基因相关肽有显著改变，并引起骨痂量和质的改变，推测降钙素基因相关肽参与调节骨折愈合过程。 【关键词】 脑损伤；胫骨骨折；降钙素基因相关肽；大鼠 The Change of Calcitonin Generelated Peptide in Tibial Fracture Callus After Bran Injury in Rats Abstract：Objective To study the relationship

3、 between the changes of calcitonin generelated peptide in tibial fracture callus and yield of callus after brain injury in rats.Methods One hundred male Wistar rats were randomly divided into brain injury plus tibial fracture group (n50) and tibial fracture group (n50).The animals were sacrificed in

4、 batches 3，7，14，21 and 28 days after operation.The concentration of ALP in serum of rats were measured.Xray plane films of the fractured tibial were taken to measure area of callus.Callus were subjected to HE staining and CGRP immunohistochemical staining.Results Concentration of ALP in serum of bra

5、in injury group were significantly higher than those in tibial fracture group at 3 d and 7 d (P0.01).The area of callus in brain injury group was larger than in tibial fracture group at 14 d and 21 d.There were a quantity of fibrous callus and cartilaginous callus formation and more CGRP immunoreact

6、ive nerve fibers in callus at early stage after brain injury.Strong immunoreactivity of CGRP was found in osteofenitor cells，chondroblasts，which proliferated in thickened endoperiosteal and amidst callus at 3 d and 7 d in brain injury group.The tibial fracture recovers rapidly and CGRP in the callus

7、 expresses highly after brain injury.Conclusion CGRP have significant effect on bone fracture healing，the expression of CGRP showed different expression in different period of fracture healing，CGRP increase in callous with brain injured rats.this fact indicated that CGRP were involved in fracture he

8、aling. Key words：brain injury；tibial fracture；CGRP；rat 临床和实验观察表明，骨的生长及修复受神经因素的影响1。众多研究表明，感觉和自主神经纤维分布在骨及骨膜上，其释放的神经肽的增加在骨痂形成的早期即可以测到，神经肽在骨折愈合重建中发挥重要作用。本实验采用免疫组织化学技术和大鼠脑损伤加胫骨骨折的动物模型，研究不同时间点胫骨骨痂中降钙素基因相关肽(calcitonin generelatel peptide CGRP)及CGRP免疫阳性神经纤维的改变和骨痂量的变化，探讨脑损伤后对骨折愈合的影响，以期从分子水平阐述神经因素对骨折愈合的影响及调控，

9、探讨神经肽与骨折愈合的相互作用的调控过程和机制。 1 材料和方法 1.1 材料 Nikon UFXA显微镜、摄像镜(日本)，HPIAS1000高清晰度彩色病理图像分析系统(中国武汉)，计算机放射成像系统(Regius model150，日本KONIC公司)，液压脑损伤模型由柳州医疗器械厂制作(参考方加胜教授)2，以上设备均由柳州市人民医院提供。主要试剂：试剂 基金项目：广西科技厅青年基金(桂科青0447055) CGRP购于武汉博士德公司。EDTA2NA(乙二胺四乙酸二钠)骨组织脱钙试剂：瑞兴科技有限公司；磷酸盐缓冲液：福州迈新生物技术有限公司(批号701020060v)。检测方法均按试剂盒要

10、求操作，雄性12周龄wistar大鼠100只，体重(50050) g，Wistar大鼠由广西医科大学试验动物中心提供(实验动物生产许可证号SCXK2003003，清洁级)。实验过程中于室温20自然光照的动物房中分笼饲养，供给大鼠标准饲料，自用饮用水，定期紫外线消毒与排风，喂养1周适应环境后随机分为骨折组和骨折合并脑外伤组，两组间无统计学差异。 1.2 方法 1.2.1 动物分组 34个月龄雄性Wistar大鼠100只，体重450550 g。随机分为两组，单纯右胫骨折组50只，编为3、7、14、21、28 d小组，每小组10只；脑外伤组加右胫骨骨折组50只，编为3、7、14、21、28 d小组，

11、每小组10只。 1.2.2 模型制作 术前禁食，大鼠随机分组并称重，经氯胺酮(1 mL/kg)腹腔内注射麻醉后，常规去毛、备皮、碘伏消毒。显露右颅顶骨，中线旁2 mm处开直径5 mm骨窗，液压打击致中度脑损伤。复苏后，沿胫骨前外侧钝性分离进入到达胫骨干，在胫骨骨干中1/3段用摆锯锯断成横形骨折，以直径1 mm克氏针作逆行髓内固定，经查骨折固定牢固后，生理盐水冲洗，关闭伤口，碘伏再消毒。骨折组头部只做颅骨开窗，正常对照组不做任何处理，术毕分笼饲养。 1.2.3 标本采集和处理 分别将受试大鼠经氯胺酮(1 mL/kg)腹腔内注射麻醉后，于术后第3、7、14、21、28天心脏取血处死，每组各10只，

12、取血46 mL离心后取血清贮存(70)待测；待血清收集齐后一批进行检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的含量。处死大鼠后立即取带骨膜和少许肌肉的右胫骨，照片后置于装有4多聚甲醛(pH7.2)瓶中，标明动物编号、日期，放入4冰箱中固定24 h。之后取出，充分水洗后，PBS液浸泡30 min，放入10乙二胺四乙酸钠(EDTA)pH7.3溶液中脱钙，每周换2次脱钙液，经5周脱钙后，用针头能轻易扎穿骨皮质，则脱钙充分。接着进行骨痂的免疫组化操作步骤。切片与胫骨纵轴垂直，连续切片，间距为6 um。具体步骤参照试剂说明书。 1.2.4 计算机X线摄像仪(CR)摄片 14、21

13、、28 d将大鼠完整的右侧胫骨干骨折标本经CR摄片(距离：90 cm，电压：40 Kvp，电流：3.0 mA)，观察大鼠胫骨骨折骨痂的连续性及骨折愈合情况。所得图像运用photoshop7进行处理，计算骨痂面积大小、不同骨痂比例。 1.2.5 免疫组织化学染色图像分析 以目标平均吸光度值为指标对所有标本切片的阳性信号进行量化。标本切片置于光镜下，每个切片选取8个视野，放大400倍后，在相同曝光条件下摄片，同时将图像输入计算机Motic数码医学图像分析系统检测阳性目标平均吸光度。平均吸光度值表示阳性信号的强度。平均吸光度值越大则信号越强，说明着色越深，抗原浓度越大。 主要观察指标：骨折合并脑损伤

14、组与骨折组大鼠术后不同时间点CGRP免疫组织化学染色的平均吸光度值；骨折合并脑损伤组与骨折组大鼠术后不同时间点ALP在血清中的浓度；组织形态学观察，骨痂面积的测量。 1.3 统计处理 运用SPSS13.0软件行统计分析，对相关指标进行t检验和方差分析。P0.05表示相比较的组别之间的差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 血清中ALP变化见表1。表1 不同损伤组大鼠各时间点ALP变化 2.2 X线片观察 将大鼠离体右侧胫骨干CR摄片，观察骨痂的连续性发现，各骨折组大鼠骨折端均未发现不愈合现象。骨折组骨折线清晰，骨痂量较少；脑外伤组骨性愈合较好，骨痂量较多，骨折线模糊。14、21 d骨痂图像分析

15、(见表2)，14、21 d脑损伤组骨痂面积比单纯骨折组大(P0.01)；21、28 d骨痂面积比较，脑损伤组变化明显快于单纯骨折组，提示骨痂塑性快(P0.01)。 2.3 组织学观察 胫骨骨折合并脑损伤组早期骨膜明显增厚，骨膜内层形成软骨细胞，纤维骨痂量较多；14 d纤维骨痂表2 两组骨痂面积测定结果 中的软骨细胞团增大，有的融合在一起，软骨内骨化少，骨膜下软骨细胞层增厚；21、28 d仍可见大量纤维骨痂和软骨骨痂，软骨细胞团周边有少量结构稀疏的编织骨形成，外骨膜下的软骨层尚未完全转变成编织骨。单纯骨折组骨膜反应轻，纤维骨痂量少，膜内成骨和软骨内成骨并存，以前者为主。 2.4 免疫组织化学观察

16、CGRP表达的时间变化规律 骨折3 d，纤维母细胞、间充质细胞、单核细胞、内皮细胞均有阳性颗粒表达。骨折1周，骨痂主要由未完全机化的肉芽组织、软骨骨痂以及小量沿骨折端骨膜下形成的编织骨组成。阳性表达广泛出现于肉芽组织的成纤维细胞样和软骨细胞、间充质细胞中，也开始在骨折端下编织骨中的成骨细胞中出现。骨折第2周，软骨骨痂占据骨折区的大部，并有部分软骨细胞趋向肥大，阳性表达在成熟的软骨细胞中密集出现。骨折第4周，软骨细胞成熟、钙化，软骨骨痂基本被骨性骨痂替代，骨膜下成骨细胞及软骨痂内成骨细胞阳性表达。脑损伤组3 d和7 d明显增厚的骨膜内层骨祖细胞、幼稚的软骨细胞胞浆内CGRP强阳性表达。CGRP表

17、达的OD值变化：术后3 d，脑外伤组OD值增加，与骨折组比较差异有显著性意义(P0.05)；术后7 d脑外伤组OD值最高，达到高峰，维持2周，逐渐开始下降；术后28 d OD值降至骨折组水平(见表3)。单纯骨折组3 d弱阳性表达，7 d才出现阳性表达，2周达高峰，随后逐渐开始下降。表3 术后不同时限两组CGRP表达OD值变化 3 讨 论 3.1 脑损伤对骨折愈合速度和骨痂中CGRP分布的影响 本实验结果表明，脑损伤组早期血清中ALP较单纯骨折组高，说明成骨活性强；脑损伤组14、21 d骨痂量较多，说明脑损伤后可使骨痂形成增多；28 d后骨痂量减少，说明塑性快。本实验结果显示，单纯骨折组骨痂中7

18、 d就有CGRP神经纤维长入，14 d后在编织骨边缘有CGRP免疫阳性神经纤维出现，21 d CGRP免疫阳性神经纤维进一步增多，28 d部分编织骨形成板层骨，神经纤维稍减少，这说明神经参与了骨痂的形成和改建过程。组织学观察表明，脑损伤组骨痂量较多，但以纤维骨痂和软骨骨痂为主。免疫组织化学染色，脑损伤组早期骨膜下大量骨祖细胞、未成熟的软骨细胞胞浆内CGRP强阳性表达，骨痂中可见少许CGRP免疫阳性神经纤维，但28 d以后骨痂中CGRP阳性表达细胞明显减少，纤维骨痂中无肽能神经纤维；单纯骨折组骨膜反应轻，骨膜有肽能神经支配，骨膜内层骨祖细胞直接形成编织骨骨痂。据此推测，由于脑损伤后早期骨痂内CG

19、RP强阳性表达，刺激纤维骨痂和软骨骨痂大量形成，加速骨折愈合。单纯骨折组，骨痂中CGRP明显减少，纤维骨痂和软骨骨痂形成慢，导致纤维骨痂和软骨骨痂向骨性骨痂转化速度也减慢。 3.2 脑损伤后CGRP影响骨折愈合机制可能如下 CGRP是广泛分布于中枢和周围神经，具有多种功能及生物活性的分子多肽，它主要在脊髓背根神经节合成，向上移行至脊髓后角，向下移行至感觉神经末梢。CGRP在神经系统和骨折组织之间起着重要的桥接作用，参与对修复细胞增殖、迁移、分化的调控3。 3.2.1 CGRP直接调节骨细胞 CGRP能与成骨细胞上CGRP受体结合，刺激成骨细胞促进成骨。CGRP还可通过与破骨细胞上的降钙素受体结

20、合，抑制骨吸收的作用。另外，它还能通过刺激干细胞有丝分裂和骨间质细胞分化，刺激骨形成。廉凯等4发现CGRP可增加成骨细胞中编码胰岛素样生长因子21(IGF21)的mRNA的表达及IGF21的合成来调节骨形成和骨吸收的平衡。 3.2.2 CGRP对局部血流量的调节 骨折的愈合需要丰富的血流。CGRP主要分布于血管周围，参于血管功能的调节，有明显的扩血管作用。CGRP是目前已知的最强的血管扩张剂之一，其强烈的扩血管作用主要是通过直接作用于血管平滑肌而实现的，部分通过内皮途径起作用。CGRP还具有刺激血管内皮细胞增生的作用，从而可促进血管长入，增加局部血流。血液供应是骨折愈合的先决条件，在骨组织周围

21、有大量的CGRP免疫阳性神经纤维，而CGRP是较强的内源性扩血管肽，神经系统可通过这些递质调节细胞功能，增加骨折局部血供。CGRP在血管内皮细胞上有受体与内皮细胞结合可使内皮细胞增生，有刺激血管生长作用。研究发现，在体循环中，神经肽的含量非常低，与其起到生理作用所需的浓度相差甚远，所以神经肽主要是由神经纤维在局部分泌而起作用的，体循环中的神经肽对骨几乎没什么影响5。 总之，研究发现骨折能诱导神经生长入骨折部位，骨折后7 d，骨痂内即可检测到蛋白基因产物(PGP 915)CGRP免疫阳性的感觉纤维。图象分析显示7 d后神经纤维增加，骨折后21 d CGRP免疫阳性的骨膜神经纤维较正常对照组增加，

22、提示这些增生的感觉纤维能产生可以影响骨折愈合的神经肽。本实验发现，脑损伤组在骨折愈合不同阶段，各种参入愈合的细胞都有CGRP阳性表达。骨折后3 d，骨痂内阳性CGRP表达，7 d即有强阳性表达。CGRP主要分布在骨膜内、外层及内骨膜，2周时达高峰，维持2周才开始下降。而单纯骨折组，4 d仅有弱阳性表达，7 d阳性表达，4周后逐渐减弱。脑损伤组，CGRP的表达提前，强度高，维持时间长，有利于刺激骨折愈合过程中各种细胞迁移增殖、分化，刺激骨痂和软骨痂大量形成。本动物实验结果发现，颅脑损伤组呈典型的成骨加速表现，即间质细胞渗入，分化为成骨细胞。大鼠胫骨骨痂量增多，早期骨痂中神经肽强阳性表达，刺激纤维

23、骨痂和软骨骨痂大量形成，骨折愈合明显加速，与人们日常观察到的脑外伤合并骨折患者，骨折愈合现象相符，这些说明脑外伤后骨折部位的CGRP的变化可能是骨折加速愈合的原因之一。但骨的形成和代谢受到机体大环境以及小环境的多层面、多途径调节，神经系统参与上述过程，发挥间接性调节作用。近来，通过一些临床观察和实验，神经因素对骨代谢和生长的直接性调节虽已经得到证实，但具体机制以及作用的重要性尚无定论。但随着神经生物学、分子生物学的深入研究，以及新的实验手段不断涌现，人们对神经调控骨的发生、形成的机制将会有更明确的认识，进而提高临床骨折治疗的质量和速度。【参考文献】 1Jones KB，Mollano AV，M

24、orcuende JA，et al.Bone and brain：a review ofneural，hormonal，and musculoskeletal connectionsJ.Iowa OrthopJ，2004，24：123132.2方加胜，袁贤瑞，刘运生，等.实验性液压脑颅损伤模型的建立与研究J.中国现代医学杂志，1995，5(2)：4647.3Ransjom，Lie A，Mukohyama H，et al.Microisolated mouse osteoclasts express VIPI and PACAP recep torsJ.Biochem Biophys Res Commun，2000，274(2)：400404.4廉凯，杜靖远.降钙素基因相关肽对鼠成骨细胞IGF1及IGF1RmRNA表达的影响J.中国矫形外科杂志，2001，8(11)：10841087.5王新，宋跃明，裴福兴.中枢神经损伤大鼠骨痂中神经肽的表达J.中国矫形外科杂志，2006，14(16)：12611264.