临床医学论文-脐带血基础免疫物质分析.doc

1、 临床论文脐带血基本免疫物质分析目的:通过研究胎儿脐带血的免疫状态，为脐带血有形成分和无形成分在免疫中的应用提供理论依据。 方法:用血常规、试剂盒、液体闪烁计数器和流式细胞仪测定白细胞分类、免疫球蛋白、细胞因子、脐带血T细胞抗原表面标志和脐带血有核细胞NK活性。 结果:与成人外周血免疫成分相比，胎儿脐带血中IgA和IgE含量明显降低，而IgG变化不明显。脐带血中GCSF和GM-CSF分别是成人外周血的11.37倍和15.81倍，TNF略低于成人外周血。中性粒细胞接近成人外周血低值，中晚期粒细胞数量明显低于成人外周血，淋巴细胞与成人外周血相当，NK细胞活性略低于成人外周血。脐带血中T细胞亚群CD

2、3+、CD4+和CD8+的数量低于成人外周血，而CD34+和CD45RA细胞高于成人外周血。 结论:脐带血富含GCSF、GM-CSF等相关造血因子和原始造血干细胞成分。虽然淋巴细胞的发育大多处于婴儿期，但大量相关的免疫细胞和细胞因子可以作为免疫治疗的基础材料。 【关键词】细胞因子免疫球蛋白脐血【摘要】目的:研究胎儿脐血的免疫状态，为胎儿脐血免疫物质在血浆免疫治疗中的应用提供理论依据。方法:采用血液常规检测试剂盒、液体闪烁计数仪和流式细胞仪分别检测白细胞分类、免疫球蛋白、T细胞抗原表面标志和NK细胞。结果:脐血IgA和IgE明显低于成人外周血，但IgG与成人外周血基本相同。脐血血浆中g-CSF和

3、GM-CSF分别是成人外周血的11.37和15.81倍，肿瘤坏死因子(TNF)略低，嗜中性粒细胞水平接近成人外周血的下限。后粒细胞和骨髓细胞水平明显低于成人外周血。白细胞水平与成人大致相同。脐带血T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+明显低于成人外周血，而CD34+和CD45RA明显高于成人外周血。NK细胞杀伤活性略低于成人血。结论:脐血中含有丰富的相关造血因子和天然造血干细胞成分G-CSF和GM-CSF，可广泛用于临床免疫治疗，尽管脐血中的T淋巴细胞大多处于发育的初级阶段。【关键词】组织因子；细胞因子；免疫球蛋白类；血；脐带血有形成分和无形成分与脐带血的免疫活性密切相关，各种活性因子的存在对

4、不同脐带血细胞的发育和功能起着重要的调节作用1 3 这些活性因子和免疫细胞与脐带血造血干细胞或祖细胞的成功移植，以及脐带血中免疫成分在抗肿瘤中的广泛应用密切相关。 国内对脐带血中有形和无形免疫活性成分的检测报道较少，因此对脐带血中相关基础免疫物质的研究具有重要意义。 材料与方法1.1胎儿脐带血采集自产科健康成年孕妇的足月正常胎儿脐带。分娩后立即用止血钳夹住脐带，一个止血钳扎住脐带，在距离脐带轮1厘米处夹住脐带，另一个钳离其2厘米处，立即剪断脐带。 快速选择母端脐动脉血管膨出处为穿刺点，常规消毒采血，收集肝素抗凝袋，6小时内应用。 1.2免疫球蛋白检测采用酶联免疫吸附试验(ELISA)。试剂盒购

5、自美国EIBIO公司，检测方法按照试剂盒说明书操作。 1.3细胞因子检测试剂盒GCSF、GM-CSF、TNF购自北京吉博生物技术发展有限公司，检测方法按试剂盒说明书操作。 1.4白细胞分类推适当厚度的血涂片，用里特染色法对涂片染色。 油镜下计数200个白细胞，根据形态特征分类，统计各类细胞的平均百分比。 1.5脐带血T细胞表面抗原标志物1.5.1淋巴细胞分离无菌提取成人外周血2 ml，EDTA抗凝(每ml含20 g/L EDTA溶液0.5 ml)，用Hanks液等稀释，用淋巴细胞分层液(1 500 r/min，20 min)分离淋巴细胞，收获单核细胞层。Hanks液洗涤3次(1 500 r/m

6、in，5 min)，用RPMI1640完全培养基制备浓度为1106/ml的细胞，在RPMI 1640培养基(100 ml/L胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰胺，100 U青霉素，50 g链霉素，20g PHA-P)中培养。 PHA-P活化24小时后，收集上层细胞悬液备用。 1.5.2淋巴细胞表面标记将试管中MNC浓度调整至1107/ml，取100 l细胞悬液，分别加入20 l荧光标记的CD3、CD4、CD8、CD34和CD45RA单克隆抗体，分别加入100 l脐带血和外周血淋巴细胞有核细胞，避光室温孵育30 min。 洗涤后，制备MNC悬浮液(1106/ml)。 流式细胞仪(FACS Vant

7、age，贝克曼库尔特，美国) 每个样本收集2 000个细胞。 用FCM软件分析计算每个标记细胞的百分比，最后用SPSS统计软件处理数据。 1.6脐血自然杀伤细胞(NK)活性测定靶细胞的制备:将浓度为1106个/ml的处于指数生长期的K562细胞加入3H-TdR，在37和5% CO2下培养4h，收集细胞并调整至浓度为1105个/ml备用。 细胞制备:从脐带血中制备有核细胞，在4107/20 ml，37 ，5 %CO2的培养瓶中种植72小时，收集细胞，调整浓度至1107/ml备用。 混合培养:取96孔培养板，每孔加入100 l靶细胞悬液(细胞对照组除外)，然后每孔加入100 l效应细胞悬液(靶细胞

8、对照组除外)，混合后培养18小时，收集后用液体闪烁分析仪(美国PACKARD公司)测定。 NK活性计算公式:脐带血基础免疫物质分析NK细胞活性=效应细胞(cpm)-细胞对照组(cpm)靶细胞对照组cpm100%2结果2.1脐带血免疫球蛋白IgG与成人外周血无显著差异，但脐带血IgA含量显著低于成人外周血(P 0.002)，IgE也显著降低(P 0.01)，见表1。 表1脐血与成人外周血免疫球蛋白比较(略)注:(1) P 0.002，(2) P 0.01 2.2免疫相关细胞因子脐带血血浆中GCSF和GM-CSF含量相对丰富，分别是成人外周血的11.37倍和15.81倍，而TNF含量略低于成人外周

9、血，无显著统计学差异，见表2。 表2脐血和成人外周血中GCSF、GM-CSF和TNF含量(略)注:(1) P 0.01，脐血与成人外周血比较。 2.3胎儿脐带血白细胞的分类从表3可以看出，中性粒细胞基本接近成人外周血的低值，而中晚期粒细胞明显少于成人外周血，淋巴细胞数量与成人外周血相当。 表3脐带血和成人外周血白细胞分类(略)2.4 T细胞抗原表面标志物从表4中我们可以看出，脐带血T细胞亚群中CD3+、CD4+、CD8+和CD34+细胞的数量与成人外周血不同，其中CD3+、CD4+和CD8+T细胞的数量低于外周血，而CD34+和CD45 RA细胞高于外周血。 表4脐带血和成人外周血T细胞抗原表

10、面标志物(略)注:(1) P 0.05，(2) P 0.01，脐带血与外周血比较 2.5脐带血的NK活性脐带血细胞的NK活性略低于成人外周血，与国外报道的结果一致。3论述胎儿脐带血含有丰富的人体所需的有形和无形成分4。为了科学合理地利用这些有效成分，进一步分析脐带血中的免疫成分是非常必要的。 本研究表明，与成人外周血相比，脐带血中IgG无明显变化，但IgA含量明显降低，IgE含量也明显降低。 进一步研究表明，除免疫球蛋白外，脐带血还含有多种造血刺激因子，其中GCSF和GM-CSF高于成人外周血，而TNF略低于成人外周血。 丰富的造血刺激因子对肿瘤脐带血的临床治疗具有重要意义。 从有核细胞的分析

11、结果可以看出，脐带血中性粒细胞的含量基本接近成人外周血的低值，而中晚期粒细胞明显少于成人外周血。淋巴细胞的数量与成人外周血相似。 T淋巴细胞分析表明，脐带血T细胞CD3+、CD4+和CD8+亚群数量低于成人外周血，CD4细胞数量与成人外周血相似，CD4/CD8比值高于成人，但CD8细胞数量低于成人外周血。但CD34+细胞数明显高于成人外周血，是成人外周血的7.28倍。 脐血CD45RA细胞高于成人外周血。CD45RA细胞的增多，说明脐带血免疫细胞的原始性，说明脐带血免疫细胞的功能还不成熟。 抗原表达和功能活性较低，脐带血相对较低的免疫活性在一定程度上有助于造血细胞功能的重建和移植后GVHD的减

12、轻。 脐带血NK杀伤活性略低于成人外周血，与Pranke P等人报道的基本一致5 NK是一种高度保守的免疫细胞，具有非特异性杀伤活性。高表达的穿孔索可以介导细胞毒性，在免疫治疗中充分发挥作用。 综上所述，脐带血中存在大量与免疫相关的有形和无形成分6，作为免疫治疗的基础，未来可能为临床免疫治疗展现出良好的应用前景。 【参考文献】【1】王力，刘德立。白细胞介素-2对脐血CIK细胞体外增殖活性的影响J.中国中医杂志，2005(4): 265-266。2，郭，乔振华.脐血免疫细胞特性的研究J.白血病和淋巴瘤，2002等。脐带血干细胞的基础与应用研究J.生命科学，2006(4):323-327。4蔡志阳，钱，等.脐血细胞天然免疫功能的测定与研究J.深圳中西医结合杂志，2005 (1): 39-41。5等.利用人脐血单个核细胞筛选具有潜在免疫调节活性化合物的平台J.梳状化学高通量筛选，2006(10):777-84。6Pranke P，Hendrikx J，Debnath G，等.胎盘/脐带血造血干细胞培养后的免疫表型J.Braz医学生物研究杂志，2005(12):1775-89。