1、 临床论文脊髓损伤细胞治疗进展作者:刘明勇、赵建华、王爱民【摘要】脊髓损伤(SCI)通常会导致灾难性的神经功能障碍，是当前研究的热点之一。 近年来，以干细胞为代表的细胞移植治疗在SCI中取得了很大进展。本文综述了脊髓损伤细胞治疗的进展。 文献表明，SCI是一个多阶段、多因素的病理过程，最终的解决方案可能在于结合多种方法的治疗策略，包括干细胞移植、减少胶质瘢痕、去除抑制分子、免疫调节和桥接受损区域的组织工程支架等。干细胞移植结合免疫调节和干预是治疗脊髓损伤的有效方法之一。 如何在损伤的脊髓组织中创造一个有利于干细胞存活并分化为神经元的微环境，如何调控免疫干预的及时性，大概将是未来的主要研究方向。
2、 【关键词】脊髓损伤；细胞移植；干细胞；树突状细胞摘要:脊髓嵌体(SCI)通常导致毁灭性的神经功能障碍，因此多年来一直是研究的热点。近年来，脊髓损伤的细胞治疗取得了显著进展，尤其是神经干细胞和树突状细胞移植策略。通过文献回顾，认为脊髓损伤是一个多阶段、多因素参与的病理过程，其解决可能依赖于综合治疗策略，包括干细胞移植、减少胶质瘢痕、清除抑制因子、免疫调节和使用组织工程支架桥接损伤。然而，将神经干细胞与免疫调节相结合的策略可能是最有前途的方法之一，面临的挑战是如何将抑制性微环境转化为更有利于神经干细胞存活和向神经元分化的微环境，以及确定免疫干预的最佳时机、程度和强度。关键词:脊髓损伤；细胞移植；
3、干细胞；脊髓细胞脊髓损伤发生率高，其特点是致残率高，死亡率低。 根据美国脊髓损伤信息网的统计，美国约有253，000名严重神经功能障碍的SCI患者，人数每年增加约11，000人，平均发病年龄38岁1 SCI严重影响患者的生活质量，给患者家庭和社会带来沉重的经济负担，因此SCI一直是基础和临床研究的重点。 脊髓损伤不可避免地导致细胞死亡。 成人脊髓虽然含有内源性神经干/祖细胞(NSPCs)，但由于自身再生能力和局部抑制性微环境的影响，难以形成有效的细胞再生，对神经功能的恢复作用有限。 因此，寻找合适的细胞和策略来替代SCI后死亡的功能细胞，从而促进神经功能的恢复，成为研究的重点之一。 近年来，以
4、干细胞为代表的细胞替代研究在SCI领域取得了一定进展，带来了SCI治疗的曙光。 本文综述了近年来细胞治疗在脊髓损伤领域的研究进展。 1干细胞移植1.1人胚胎干细胞(hESCs) 1998年，Thomson等人2首次发现hESCs具有多向分化潜能，分化为多种体细胞，引起了极大的关注。 Vadivelu等3通过大脑兴奋毒性损伤模型证实，移植的人胚胎干细胞可以表达血管内皮细胞、胶质细胞和不同神经元亚型的免疫标志物，并能形成形态正常的突触。 Nayak等4也在肌萎缩侧索硬化的实验模型中证实了胚胎干细胞可以形成功能性运动神经元，为ESCs在SCI中的应用提供了新的实验依据。 理论上，人胚胎干细胞可以分化
5、成任何种类的体细胞，并可能治愈许多疾病。然而，获得人胚胎干细胞需要破坏人类胚胎，由此引发的伦理和法律问题一直困扰着人胚胎干细胞的研究。 Klimanskaya等人5成功地从桑椹胚阶段的单个卵裂细胞中培养出人胚胎干细胞，从理论上避免了困扰人胚胎干细胞研究的伦理问题。 然而，人胚胎干细胞的研究仍面临许多问题。 首先，人胚胎干细胞可能诱导免疫排斥。 研究表明，未分化的人胚胎干细胞可能通过低水平表达人类白细胞抗原 (HLA )来逃避宿主的排斥反应，而不能表达人类白细胞抗原 (HLA )，但完全分化的人胚胎干细胞是否仍能逃避宿主的免疫排斥反应仍是未知数。 其次，人胚胎干细胞可能具有潜在的致瘤性。 人胚胎
6、干细胞具有癌细胞的一些特征，如基因不稳定、缺乏自限性、DNA修复活性增强等。这导致了潜在的致瘤性，限制了人胚胎干细胞的应用。 最近的研究表明，通过分子生物学和细胞筛选技术，人胚胎干细胞可以在体外分化培养成熟的胶质细胞，损伤的轴突可以在SCI后重新髓鞘化6 然而，人胚胎干细胞的潜在致瘤性一直是其研究的局限性之一。 最近于等7通过病毒基因转移成功地从成体体细胞分化出来，这种细胞类似于ESCs，具有分化成多种细胞的潜能。 这一发现为避免ESCs研究的伦理限制和免疫匹配提供了可能。 但这种细胞携带病毒基因，整合到宿主DNA中是否会引起突变，还需要进一步研究。 1.2 20世纪70年代首次报道胎儿干细胞
7、利用胎儿组织移植治疗中枢神经系统(CNS)和帕金森病。 最近有报道称，胎儿神经前体细胞可分化为神经元和少突胶质细胞，可促进移植后SCI神经功能的恢复8 由于资源有限，胎儿干细胞的研究受到很大限制。 随着脐带血库的完善，胎儿干细胞的来源增加了。 有学者利用脐带血制备干细胞，并用于促进SCI后轴突的髓鞘再生，增加神经营养作用9 但脐带血干细胞的特性、促进SCI神经功能恢复的程度及其机制仍需要大量的实验来验证。 1.3成体神经干/祖细胞(aNSPCs)目前已发现大脑和脊髓中均存在aNSPCs。 这种细胞具有很强的自我更新和向其来源组织的所有细胞成分分化的能力。 但实验也发现，这些细胞异位移植到其他组
8、织(如脊髓)后，存在转分化的可能性。 然而，ANPS PCS避免了困扰ESCs和胎儿干细胞再生研究的伦理和法律问题，因此有许多关于其研究的报道。 许多研究证实，ANPS PCs可以促进SCI后神经再生、少突胶质细胞髓鞘再形成等病理过程，从而促进神经功能的恢复10 最近Eftekharpour等11利用绿色荧光标记的aNSPCs修复大鼠颌骨损伤的SCI模型，取得了一定的效果。 本实验所用的成体神经干细胞来自大鼠脑室下区，培养体系中含有1%的神经干细胞(NSCs)和99%的成体神经干细胞。 为了模拟亚急性和慢性SCI，作者分别在损伤后2周和8周移植细胞。 结果表明，亚急性期NPCs存活率约为40%
9、，其分布主要局限于脊髓白质，但主要分化为胶质细胞，这可能与脊髓局部微环境有利于胶质细胞分化有关。 成年NPC慢性移植后很难存活。 这可能与脊髓局部抑制性微环境和神经营养因子不足有关12 此外，干细胞移植的数量和时机也同样重要 结果表明，SCI后第一周，局部免疫反应强烈，不利于干细胞存活，而第二周移植效果较好。干细胞的合适数量是1106 13 1.4间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs) MSCs来源于胚胎中胚层，保持干细胞核心的自我更新和多向分化潜能，分化为不同的结缔组织细胞。 MSCs已用于SCI模型的实验研究，但MSCs能否分化为神经细胞仍有争议。 Phin
10、ney等14发现，一些研究证实，MSCs在体内可以表达巢蛋白和成纤维细胞酸性蛋白(GFAP)，并在特定的培养环境中呈现神经元样形状，因此认为MSCs可以转分化为神经细胞。 然而，巢蛋白和GFAP不是神经组织的唯一标记，也在来自中胚层的其他组织中表达，如肌肉和软骨。 但形态学的相似性可能是由于特定培养基的假阳性，而无法得到神经元特定功能检测如神经生理学的支持。因此，MSCs能否转分化为神经细胞有待进一步研究，MSCs移植促进CNS受损功能恢复可能是由于其具有分泌生长因子或调节局部免疫反应的能力。 卢等15将携带神经营养因子基因的骨髓间充质干细胞移植到慢性SCI大鼠体内，发现间充质干细胞可促进轴突
11、再生并通过胶质瘢痕，但实验中未观察到神经功能的恢复，说明再生的轴突未能与宿主组织形成有效的突触连接。研究还表明，MSCs可能通过神经保护途径促进神经功能的恢复，如抑制Fas介导的神经元凋亡。 许旺细胞和嗅鞘细胞(OECs)许旺细胞是周围神经系统中髓鞘的组成细胞，在通过髓鞘再形成策略治疗中枢神经系统疾病中，它们常被用作替代细胞。 由于雪旺细胞在临床上容易制备，虽然存在神经炎的风险(与硫酸软骨素蛋白聚糖形成增加有关)，并且可能加重神经痛的发生，但关于SCI中内源性OECs的浸润分布及其对髓鞘形成的影响的文章仍然很多。 周围神经系统损伤后，许旺细胞通过分泌神经营养因子和细胞外基质成分，为轴突再生提供
12、良性环境，最终实现轴突的髓鞘再形成。 研究表明，许旺细胞移植入SCI后可与宿主组织融合，实现感觉神经轴突的再生和轴突的髓鞘化，促进动物后肢功能的轻度改善。 还发现脊髓空洞症中虽然可以存在内源性许旺细胞，但存活率很低16。虽然皮肤来源的许旺细胞可以在脊髓空洞症中存活，并诱导轴突再生和髓鞘形成，但这些轴突的分布和功能需要进一步研究。 嗅鞘细胞的表型特征与许旺细胞相似，联合移植可加强许旺细胞的治疗效果。 有学者认为OECs不仅与轴突再生有关，还与SCI后的髓鞘再形成或脱髓鞘有关。相反的结论也有报道16 矛盾结果的原因可能与不同的供体年龄和细胞分离方法有关。 OECs和Schwann细胞都表达神经营养
13、受体(p75)，后者通常用于纯化OECs。因此，雪旺细胞对OECs的污染可以部分解释OECs在轴突髓鞘化中观察到的矛盾结果，电镜观察也证实了OECs是轴突再生的主要支持细胞，为内源性雪旺细胞髓鞘化提供了结构骨架。 根据传统的免疫细胞理论，免疫反应导致SCI的继发性损伤，而CNS是有害的或参与了继发性损伤。 然而，越来越多的证据表明，适度的免疫反应对于SCI的治疗是必要的，并具有重要的神经保护作用。 1990年，David等17发现巨噬细胞和小胶质细胞介导的免疫反应可以促进轴突再生，部分逆转哺乳动物中枢神经系统损伤的不可逆状态。 研究还证实，SCI后的保护性免疫反应主要是T细胞介导的细胞免疫18
14、 Schwart等19的进一步研究证实，TH1细胞(辅助细胞1)是自身免疫性疾病的病因，并具有神经保护作用。 Yoles等人20证实，天然存在的CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)抑制了中枢神经系统损伤后保护性T细胞介导的免疫反应。 然而，对过度表达髓鞘碱性蛋白(MBP)反应性T细胞受体的转基因小鼠的研究表明，视神经损伤(ONI)小鼠的视神经节细胞存活率高于野生型小鼠。 然而，Jones等人21使用相同转基因小鼠的研究显示了相反的结果。 在该实验中，转基因小鼠中超过95%的CD4+T细胞是MBP特异性T细胞。 结果表明，转基因小鼠后肢承重能力明显弱于野生小鼠，轴突脱髓鞘和损伤范围重于野生
15、小鼠。 实验还证实，SCI后转基因小鼠外周淋巴组织中细胞因子的增加主要是TH1细胞分泌的白细胞介素2 (IL 2)和干扰素 (IFN ),而TH2细胞分泌的il4和il5也有所增加。但IL-10分泌减少。 后者是脊髓损伤的潜在保护因素。 上述实验相互矛盾的结果显示了SCI后免疫反应的复杂性。 说明治疗SCI必须严格控制局部免疫。 由于Th1、Th2和Treg等功能性淋巴细胞的激活和分化都与树突状细胞(DC)的调节有关，因此DC在SCI中的作用近年来越来越受到重视。 树突状细胞是一种专职的抗原提呈细胞，在调节脊髓损伤的免疫反应中起着重要作用。 Schwartz等22的研究小组发现，树突状细胞移植
16、可增加神经营养因子3 (NT3)和IL-2等保护性细胞因子的表达，促进受损SCI功能的恢复，已用于临床实验并取得良好效果，从而提示树突状细胞调节的免疫反应在SCI修复中具有重要的神经保护作用。 Hauben等23证实，大鼠SCI后，局部损伤或给予负载髓鞘碱性蛋白的树突状细胞(mbpDCs)可显著促进神经功能恢复，改善神经组织病理状态，效果优于单独使用DCs。 Mikami等24证实，DCs在体外可以增加NSPCs的存活和分化；共移植后，可激活内源性神经干细胞启动神经再生，分泌NT-3，激活小胶质细胞，从而促进小鼠脊髓损伤功能的恢复。 刘等25发现负载脊髓匀浆蛋白(hpDCs)的树突状细胞用于修
17、复c系小鼠脊髓损伤。经过84天的实验观察，结果表明，hpDCs能显著促进小鼠脊髓损伤后神经功能的恢复，增加体内巢蛋白的表达，减少GFAP的表达，减少瘢痕厚度，缩小脊髓腔。 以上研究均证实，免疫细胞在SCI的修复中发挥着重要作用。 结论干细胞、免疫细胞等细胞移植治疗脊髓损伤已取得一定进展。其中，神经干细胞可以分化为神经细胞，修复组织缺损，提供营养支持，并可能在良好的调节下建立新的突触连接。 因此，干细胞治疗可能给脊髓损伤的治疗带来曙光，并可能取得突破。 目前，细胞治疗SCI的主要目标是:(1)促进神经元再生；(2)促进髓鞘再生；(3)提供营养分子以促进细胞保护；(4)调节局部免疫反应。 最终目标
18、是增加内源性神经干细胞的潜能。 而损伤后激活的内源性成体NPCs功能有限，难以有效弥补受损细胞。最终的解决方案可能是采取多种联合治疗策略，包括减少胶质瘢痕、去除抑制性分子、免疫调节以及用组织工程支架桥接受损区域等。 如何在损伤脊髓组织中创造有利于干细胞存活和分化为神经元的微环境，如何调控免疫干预的及时性，可能是今后研究的主要方向。 1Jackson AB，Dijkers M，DeVivo MJ，等.新创伤性脊髓损伤的人口统计学特征:30年的变化和稳定性J.Arch Phys Med Rehabil，2004，85(11):1740-1748。2Thomson JA，Itskovitz Eldo
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