临床医学论文-脊髓损伤后线粒体超微结构和呼吸功能的变化.doc

1、 临床论文-脊髓损伤后线粒体超微结构和呼吸功能的变化【摘要】探讨大鼠损伤脊髓线粒体超微结构和呼吸功能的变化。 方法将48只SD大鼠随机分为对照组(假手术组)和脊髓损伤组(SCI组)，每组在治疗后6、12、24h又分为3组，每组8只。采用Allens叩诊法建立大鼠脊髓损伤模型。提取各期损伤脊髓线粒体，透射电镜观察线粒体超微结构变化。克拉克氧电极法测定线粒体呼吸功能，根据线粒体呼吸耗氧量计算R3、R4、RCR和P/O比值。 结果SCI组脊髓组织线粒体体积增大，嵴轻度肿胀，嵴内腔扩张，部分线粒体膜结构不清，嵴紊乱，部分神经细胞高尔基体和内质网轻度肿胀。 随着损伤后时间的延长，部分线粒体嵴断裂溶解，膜

2、破裂，线粒体数量减少。 在伤后6、12和24h，SCI组的R3、RCR和P/O显著低于对照组，R4显著高于对照组，差异有显著统计学意义(P 结论脊髓损伤大鼠线粒体超微结构发生明显变化。损伤脊髓线粒体呼吸功能明显下降。 关键词线粒体超微结构摘要:目的研究实验性脊髓损伤时脊髓线粒体超微结构和呼吸功能的变化。方法采用改良Allen法建立48只成年SD大鼠脊髓损伤模型。在脊髓损伤后6、12和24小时，采用改良Estabrook法从损伤脊髓组织中提取线粒体。观察超微结构变化和呼吸功能，包括R3、R4、RCR、P/O。结果线粒体超微结构严重受损。结果显示，损伤后脊髓线粒体R3、RCR和P/ O值较正常对照

3、组显著降低(P 神经元死亡是一些神经系统损伤的共同特征，其中线粒体功能障碍和线粒体介导的神经元凋亡在其发生发展中起着重要作用1 细胞活动所需能量的90%以上由线粒体氧化磷酸化提供。 当线粒体内能量物质的合成受阻，细胞内各种耗能生物反应中断时，可引起一系列变化，如氧自由基生成增多、离子泵功能受损、细胞内Ca2+超载、细胞膜通透性增加、细胞肿胀坏死等2 目前，关于脊髓损伤后线粒体等细胞器超微结构和功能变化的报道很少。 材料与方法1.1动物分为48只健康成年SD大鼠，雌雄不限，体重25030 g，随机分为对照组(假手术组)和脊髓损伤组(SCI组)，每组在治疗后6、12、24h又分为3组(每组8只)。

4、提取损伤脊髓线粒体，测定其呼吸状态 (R3)和呼吸状态 (R4) 1.2模型制备:1.0%戊巴比妥钠以40 mg/kg体重腹腔麻醉，以T8、9为中心，暴露脊髓T8、9段，在暴露的硬脑膜表面放置3 mm2的弧形垫。 采用Allen脊髓损伤模型，损伤能量为10 g5 cm。 术后处理:室温保持在23 25，保持干燥通风。 每只老鼠都被关在笼子里，饮食不受限制。术后定期协助脊髓损伤大鼠排尿排便。 1.3脊髓线粒体的提取按estabrook 3方法，各组在伤后相应时间取出损伤脊髓，用预冷的生理盐水冲洗脊髓，用滤纸吸干后称重。 将16 ml/g的分离介质加入到Teflon core匀浆器中并匀浆。 将匀

5、浆倒入预冷的离心管中，3 000 r/min离心10 min，取上清液，平衡，15 000 r/min离心10 min。 丢弃上清液，用分离介质彻底冲洗沉淀物，并以15 000 r/min的速度离心10 min。 弃去上清液，在沉淀物中加入少许分离介质，约0.5ml，制成线粒体悬液，约10 mg/ml，置于冰浴中备用。 整个分离过程在冰浴中进行，离心在0 4进行。 1.4线粒体功能指数的测定线粒体的呼吸功能测定采用Clark氧电极法1:用蒸馏水冲洗氧电极表面，向表面加入几滴0.5 mmol/L的KCl溶液，覆盖约3 cm3 cm的清洁膜并固定。 小心地将电极插入电极杯底部。 向反应杯中加入蒸馏

6、水，搅拌，并保持反应室的温度在30。30分钟后，电极将达到平衡。此时反应室的瓶盖不会被盖上，反应杯中的氧气会与大气平衡，然后进行校准。 控制器各旋钮置于最小位置，然后慢慢打开灵敏度旋钮，使记录仪指针达到满刻度。 稳定后，向反应杯中加入少量连二亚硫酸钠粉末，除去水中所有氧气，立即盖上瓶塞，记录笔逐渐回到零位。 根据氧饱和溶解度(30时氧在水中的饱和溶解度为0.23 mol/ml，计算公式为:每个细胞中的氧含量(mol)=0.232.5个返回细胞)计算记录纸上每个细胞中的氧含量 将平衡记录器的进纸速度设置为8毫米/分钟。 吸取反应杯中的校准溶液，用蒸馏水冲洗2 3次，然后吸干，加入2.5 ml测量

7、介质，关闭玻璃塞，开启电磁搅拌器，使测量介质达到所需温度。 从孔中加入1 mg线粒体，孵育1 min，从孔中加入20 l琥珀酸，2 min后加入10 l ADP，得到的曲线处于呼吸III状态，ADP耗竭后得到的曲线处于呼吸IV状态。 计算公式(1)呼吸态(R3)=态每分钟氧含量(nmol O/mgpr/min) (2)呼吸态(R4)=态每分钟氧含量(nmol O/mgpr/min) (3)呼吸控制率(呼吸控制率，RCR)=呼吸/呼吸(4)P/O比P/O)= ADP浓度(nmol)/呼吸耗氧量(nmol O)透射电镜观察线粒体超微结构变化。 从各组脊髓组织中提取线粒体1 mm3见方片，4前在2%

8、戊二醛PBS固定液中固定1小时，在0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PB，PH7.4)中洗涤2次，每次10 min2，4过夜。 1%锇酸(0.1 mol/L PB制剂)在4固定2小时，PBS缓冲液在4洗涤10分钟两次，30%、50%、70%和100%乙醇各脱水10分钟，90%乙醇-90%丙酮、90%丙酮和100%脱水三次。618包埋液与环氧乙烷(1:1)浸泡2小时，618包埋液与环氧乙烷(1:2)浸泡过夜，纯618包埋液37浸泡2小时，60烘箱包埋48小时。 18包埋液和环氧丙烷浸泡包埋。切厚片定位后，制成超薄片，捞出在铜网上。 柠檬酸铅电子染色，透射电镜观察 1.5统计处理的所有参数均以s表示，

9、实验组间差异的显著性用t检验判断。 P 2结实2.1线粒体超微结构变化(图1)电镜下主要观察脊髓神经元的线粒体、突触、细胞核等内膜结构的形态。 正常脊髓内的线粒体多为圆形或椭圆形，膜结构清晰，嵴密集，排列整齐(图1)。 SCI组脊髓组织线粒体体积增大，嵴轻度肿胀，嵴内腔扩张，部分线粒体膜结构不清，嵴紊乱(图2) 随着伤后时间的延长，可以看到部分线粒体嵴开始断裂溶解，膜破裂，线粒体数量减少(图3、4)。 2.2呼吸功能和线粒体氧化磷酸化的变化(表1-4)表1-3显示SCI组在伤后6小时、12小时、24小时R3和RCR显著低于对照组，R4显著高于对照组，具有极其显著的统计学意义(P 结果表明，损伤

10、脊髓线粒体内底物、呼吸链和ATP/ADP转位的通透性受到明显影响，线粒体氧化磷酸化偶联程度受到明显抑制。 线粒体的P/O直接反映了线粒体氧化磷酸化的变化。 表4显示，损伤后各阶段SCI组的P/O显著低于对照组，差异非常显著(P 说明损伤脊髓线粒体将氧化释放的能量转化为ATP的效率明显降低。 表1线粒体R3变化表2线粒体R4变化3近年来的讨论发现，线粒体功能正常与否是决定细胞生存或死亡的关键因素。 细胞的能量代谢紊乱，以及凋亡或坏死等一系列细胞病理反应过程，都与线粒体的结构和功能异常有关。 细胞活动所需能量的90%以上由线粒体氧化磷酸化提供，因此线粒体功能的改变直接影响神经细胞的功能。 图1正常

11、脊髓组织中的线粒体(8 000个)呈圆形或椭圆形，膜结构清晰，嵴致密，排列整齐。图2脊髓损伤后6 h，脊髓组织中线粒体(8 000个)体积增大，嵴轻度肿胀、紊乱，部分线粒体膜结构不清。图3脊髓损伤后12 h脊髓组织中线粒体(8 000)嵴轻度肿胀、部分断裂、溶解图4脊髓损伤后24h脊髓组织中线粒体(8 000)可见嵴断裂和膜破裂线粒体呼吸功能的重要参数为R3、R4、RCR (RCR = R3/R4)和P/O比值4 R3反映线粒体内膜的底物通透性(底物载体)、呼吸链、ATP合成酶和ATP/ADP易位。R4反映了线粒体内膜的天然质子传导性，即内膜的通透性；RCR反映了线粒体的结构完整性和功能状态，

12、这是一个非常敏感的指标，直接反映了氧化磷酸化偶联的程度。P/O比是指线粒体利用氧化释放的能量转化ATP的效率，是氧化磷酸化效率的重要指标。P/O比值的降低表明氧化磷酸化解耦。 发现脊髓和脑外伤早期(伤后6 12小时)线粒体呼吸活性R3、RCR、P/O和OPR显著下降，而R4相对正常或升高5 本实验中，损伤后脊髓损伤组R3明显低于对照组，差异非常显著(P 说明损伤脊髓线粒体膜中底物、呼吸链、ATP/ADP易位体等的通透性受到明显影响，线粒体膜通透性增加，这也说明损伤线粒体RCR的变化是由R3减少和R4增加的共同变化引起的。 线粒体氧化磷酸化的偶联程度明显受到抑制，氧化释放的能量转化为ATP的效率

13、明显降低。 电镜病理检查也显示SCI后神经元线粒体有明显损伤，与线粒体功能障碍相一致。 大分子结构是功能的基础。一般认为是分子结构先变，功能后变。脊髓损伤后线粒体呼吸功能的变化必然会反映内膜和基质的变化。 这些变化的可能机制有:(1)线粒体膜损伤:创伤后，膜通透性增加，肿胀，内膜蛋白质和脂质成分丢失，结构有序改变，严重质子渗漏，导致H+泵紊乱，甚至内膜去能，膜转运功能下降，基质水肿，氧化磷酸化功能下降，电子传递活性下降，ATP合成减少。 脊髓损伤后，ATP酶活性受到抑制，严重损伤脊髓水电解质紊乱加重，最终导致线粒体膜加重。 (2)产生一些线粒体呼吸抑制剂或解偶联剂6:脊髓损伤后，神经细胞膜上的

14、Ca2+通道打开，细胞外大量Ca2+进入细胞，引起细胞内Ca2+超载，同时激活磷脂酶，释放膜磷脂和脂肪酸，增加游离脂肪酸。 脊髓损伤时，儿茶酚分泌增加，甘油三酯脂肪酶也可被cAMP激活，脂肪酸释放增加。 此外，创伤后自由基生成增多，膜肽链断裂变性，导致线粒体脂质变薄，流动性降低，出现孔隙，影响其氧化磷酸化。 (3)脊髓缺血缺氧使NADH不能通过呼吸链被氧化成NAD+，NAD+/NADH比值下降，抑制柠檬酸合成酶的活性，三羧酸和ATP合成功能下降。 内膜通透性受损是解耦的表现7 状态的速率(R3)取决于状态的任何限速步骤，主要包括底物通透性(底物载体)、底物脱氢酶、呼吸链、ATP合酶和腺苷酸转位

15、。 线粒体R4增加可使线粒体内膜通透性增加， h+减少，可诱导线粒体释放其基质中的物质如细胞色素C，激活蛋白酶如caspase 9/3，引起细胞凋亡。 SCI组R4升高，R3降低，说明底物载体、底物脱氢酶和呼吸链未受影响。 因此，R3的降低表明ATP合酶活性的降低或腺苷酸转运结构的改变。 腺苷转运蛋白位于线粒体内膜上，蛋白质结构异常会影响ADP的转运，从而影响ATP的合成。 同样，ATP合酶活性的降低也使ATP合成减少，最终导致线粒体的能量代谢紊乱。 大量Ca2+进入细胞，细胞内Ca2+浓度升高抑制代谢活动。过量的Ca2+破坏了线粒体的电子传递链，停止了ATP的产生，意味着所有依赖ATP的生命

16、活动都停止了。同时大量乳酸积累，产生大量自由基，加重神经的二次损伤。 由于继发性脊髓损伤病理机制复杂，线粒体在继发性脊髓损伤机制中的作用，如线粒体功能变化对神经细胞凋亡的影响及其在神经细胞凋亡信号转导机制中的作用，还有待进一步研究。 参考文献 1勒马斯特斯JJ。选择性线粒体自噬，或拓扑结构，作为针对氧化应激、线粒体功能障碍和衰老的靶向防御J。复兴研究，2005年，1:3-5。2佐罗夫DB。线粒体损伤是疾病和衰老的一个来源:如何对抗这些疾病的策略。生物化学生物物理学学报，1996年，12: 10-15。3邵，肖建如，等.颈髓损伤对颈髓细胞线粒体膜流动性和线粒体呼吸功能的影响J.中国创伤杂志，20

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