临床医学论文-脊髓损伤后低剂量FK506对伤段组织电解质水含量失衡的早期保护作用.doc

1、 临床论文小剂量FK506对脊髓损伤后受损脊髓组织电解质水含量失衡的早期保护作用作者:、朱、陈、郭、陶风华【摘要】【目的】探讨早期应用小剂量抗移植排斥药物fk506对受损脊髓组织钙、镁离子和水含量的影响，并阐明其神经保护作用的可能机制。 方法将35只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、损伤组和治疗组。 采用Allens叩诊法制作脊髓损伤模型，对照组仅行椎板切除术。 治疗组于脊髓损伤后5 min经尾静脉一次性注射FK506 (0.3 mg/kg)，其余两组注射0.9%生理盐水。 术后6、12、24h，干湿法测定损伤脊髓组织含水量，原子吸收光谱法测定钙、镁离子。 结果损伤脊髓含水量和钙离子水平升高

2、，伤后12 h达到高峰，而镁离子水平下降。FK506能显著改善上述变化(P 结论小剂量FK506可减轻损伤脊髓组织的水肿和电解质失衡，对继发性脊髓损伤具有神经保护作用。 【关键词】脊髓损伤；钙；镁；水肿；神经保护药物小剂量他克莫司对大鼠嵌入式脊髓组织水电失衡的早期保护作用摘要:目的研究小剂量他克莫司对损伤脊髓组织中钙、镁和水含量的影响，阐明其神经保护机制。方法将35只雄性大鼠随机分为3组:对照组、损伤组和他克莫司治疗组，后2组大鼠在T10椎体水平用落锤(10 g重物从4.0 c m高处落下)造成脊髓挫伤。他克莫司治疗组在脊髓损伤后5分钟注射他克莫司，其他组同样注射0.9 %生理盐水。大鼠于脊髓

3、损伤后6、12、24小时处死。用干湿法和原子吸收光谱法分别测定损伤脊髓组织的含水量和钙、镁含量。结果脊髓损伤后，损伤脊髓组织的含水量和钙值呈上升趋势，伤后12 h达到高峰，镁值呈下降趋势。与损伤组相比，他克莫司治疗组的失衡明显改善(P 已明确脊髓损伤后电解质失衡导致的微循环障碍、组织水肿和代谢紊乱在继发性损伤中起重要作用，尤其是细胞内钙超载被认为是神经细胞死亡的“最后通道”1 许多学者以此为切入点，对脊髓损伤的药物治疗进行了有益的探讨。 近年来，临床上广泛使用的抗移植排斥药物-FK506(他克莫司)被证明具有有效的神经保护作用2 本研究从脊髓损伤后的生化变化探讨了FK506对损伤脊髓组织中钙、

4、镁、水含量的影响，阐明了其神经保护作用的可能机制。 材料与方法1.1实验动物分为35只成年雄性健康Wistar大鼠，体重220280 g，由武汉大学实验动物中心提供。 他们被随机分为3组。治疗组:15只大鼠脊髓损伤后vein经尾静脉注射FK506 (0.3 mg/kg)一次；损伤组:15只大鼠脊髓损伤后5 min经尾静脉注射等量生理盐水；对照组:5只大鼠，椎板切除后5分钟，经尾静脉注射等量生理盐水一次，不损伤脊髓，作为正常对照组。 1.2脊髓损伤模型大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉。损伤组和治疗组采用Allens法建立脊髓损伤模型:切除T9 T10棘突和椎板，暴露硬膜囊。一根

5、重10 g的金属棒从4.0 cm的高度自由落体撞击硬脑膜囊，撞击能量为4.0 cm10 g，损伤直径约3.0 mm，金属棒下的后倾大鼠迅速出现摇尾反射，后肢回缩、拍打身体后出现弛缓性麻痹，说明撞击成功，止血后缝合切口。 对照组仅行T9 T10椎板切除术。 术后小心喂养，每8小时手动按压排尿 1.3治疗组和损伤组分别于术后6、12、24小时处死动物，每个时间点5只。在原切口处暴露脊髓损伤区，迅速取出长度约10 mm的损伤脊髓组织。首先用冷生理盐水冲洗表面的血液，轻轻去除硬脑膜，用滤纸吸收表面液体。然后放入样品称量杯中，用电子天平称量，再放入-20冰箱中备用。 对照组中的5只大鼠用同样的方法取样。

6、 1.4组织含水量的测定取出冰冻标本，放入电热恒温鼓风干燥箱中，在962干燥48 h至恒重(两次称量值之差 1.5钙镁离子含量的测定向装有干燥样品的瓶中加入5 ml浓硝酸和高氯酸混合溶液(体积比:5: 2)，室温下消化48h，将消化后的溶液转移至烧瓶中，然后放入500左右的石棉炉中，使样品无机化。 用5%盐酸溶液溶解烧瓶中的无机物，然后转移到25 ml容量瓶中，定容后用原子吸收分光光度计测定钙镁离子含量。脊髓组织中钙镁离子含量( mol/g干重)=测量溶液中钙镁离子浓度/样品干重稀释倍数，测量波长Ca2+为422.7 nm，Mg2+为289 nm。 1.6统计处理采用正版统计分析软件SPSS

7、12.0，计量数据以均数标准差(S)表示，两组间比较采用t检验，P 结果2 2.1损伤脊髓含水量对照组大鼠脊髓平均含水量为(63.351.70)%。 A组大鼠损伤脊髓组织含水量在伤后6小时显著增加，伤后12小时达高峰，伤后12 24小时仍维持在较高水平。 治疗组大鼠脊髓组织含水量在伤后6h也有所增加，但明显低于损伤组(P 见表1。 表1大鼠脊髓损伤后各时间点损伤脊髓组织含水量(略)注:与损伤组相比 A组损伤大鼠脊髓组织Ca2+含量在伤后6小时显著升高，是对照组水平的2倍以上，伤后12小时达高峰，随后缓慢下降。 治疗组Ca2+含量明显低于损伤组(P 对照组大鼠脊髓中平均Mg2+含量为(9。611

8、.57) mol/g干重。 伤后6h，损伤组和治疗组大鼠脊髓内Mg2+含量明显下降，但两者之间无显著性差异(P0.05)。两组大鼠脊髓内Mg2+含量在伤后12 24小时内总体呈上升趋势，但损伤组Mg2+恢复较慢，基本停滞在5.9 mol/g干重左右，而治疗组Mg2+含量明显升高，并在24小时内开始升高。 表2大鼠脊髓损伤后不同时间点脊髓组织内Ca2+含量(略)注:与损伤组相比 近年来发现，由fk506和fkbp12形成的fk 506 fkbp 12复合物通过抑制CaN活性发挥神经保护和神经再生作用。 如Macleod和Butcher 4表明fk 506 FKBP 12复合物阻断了CaN介导的一

9、氧化氮合酶(NOS)的激活，降低了NO的神经毒性，从而保护了损伤的局部神经组织。 Keswani等人5的研究发现，FK506通过抑制CaN而增加生长相关蛋白43(GAP-43)的活性，从而起到促进神经再生的作用。 Lopez Vales等2进一步证实，在大鼠脊髓损伤模型中，FK506可以减少继发性损伤的面积，促进脊髓功能的恢复。 上述研究表明，FK506极有可能为甲基强的松龙后脊髓损伤的药物治疗开辟一条新的可能途径。 同时，笔者也注意到，目前在这种神经保护剂的研究中，主要从组织病理学和行为学的角度探讨了FK506的神经保护作用机制，而对其对脊髓损伤后早期生化变化的影响却很少涉及。 不可否认，脊

10、髓损伤后即刻损伤区微循环障碍和电解质紊乱导致的组织水肿和代谢紊乱在继发性损伤中起着重要作用。弄清FK506对上述生化变化的影响是本研究的意义所在。 根据本实验测定的生化指标，脊髓损伤后24小时内，特别是伤后12小时内，损伤脊髓组织中的含水量显著增加，说明损伤后早期脊髓组织中出现了继发性水肿，而此时局部组织中的Mg2+含量显著下降，伤后24小时内基本保持停滞状态。另一方面，在脊髓损伤后早期给予FK506，伤后24小时内局部组织含水量明显下降，而Mg2+含量在伤后12 24小时内有较大程度的恢复。 这说明:(1)Mg2+含量的变化与脊髓继发性水肿的程度呈负相关；(2)脊髓损伤后，局部组织难以通过自

11、我调节机制将Mg2+含量恢复到正常水平；(3)伤后早期给予FK506可促进损伤脊髓组织Mg2+水平的恢复，有助于防止脊髓继发性水肿的恶化。 Akino等6的实验也表明，脊髓损伤后局部组织中Mg2+含量降低，且Mg2+降低程度与脊髓损伤程度呈正相关，与本实验结果相互印证，表明Mg2+降低可能参与了脊髓的继发性损伤过程。脊髓损伤后，早期补充Mg2+或用适当的药物促进Mg2+含量的恢复，可减轻Mg2+水平下降引起的继发性损伤。 Mg2+是非竞争性N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂，可阻断NMDA受体上的离子通道，抑制兴奋性氨基酸(EAA)的释放7，从而拮抗EAA造成的损伤。 此外，Mg2+

12、对脊髓损伤的保护作用可能还取决于其对Ca2+的拮抗作用。 脊髓损伤直接增加细胞膜对Ca2+的通透性，导致Ca2+清除功能障碍。大量Ca2+流入并积聚在细胞内，造成细胞内Ca2+超载。 细胞内高钙可激活多种蛋白酶和磷脂酶A2，产生大量病理性自由基参与脂质过氧化，广泛损伤细胞器和膜结构。Ca2+还参与微血栓形成，收缩微血管，导致局部微循环障碍。大量Ca2+内流沉积在线粒体内，引起能量代谢紊乱，增加细胞膜对其他离子的通透性，引起细胞内Na+聚集和细胞水肿8 本实验观察到脊髓损伤后24小时内，损伤脊髓组织内Ca2+含量显著升高，与脊髓继发性水肿的时间和严重程度呈平行关系。 因此，正如杨等1所指出的，脊

13、髓损伤后Ca2+内流引起的细胞内Ca2+浓度升高是脊髓损伤过程中神经细胞死亡的最终共同途径。 Mg2+通过与Ca2+竞争细胞膜上的结合位点来抑制Ca2+内流。促进Mg2+-Na+交换抑制Ca2+-Na+交换，阻止Ca2+内流；细胞外Mg2+可以通过Mg2+-Ca2+交换促进Ca2+外流。 如佐伯等9报道，脊髓缺血损伤前20分钟给予Mg2+可减轻脊髓继发性病理损伤，损伤后24小时内神经损伤严重程度评分明显低于对照组。 在本实验中，经FK506处理后，局部组织中Mg2+含量增加，Ca2+含量显著降低，脊髓继发性水肿的明显改善也为其神经保护作用提供了证据。 但本研究观察到的Ca2+含量的降低，究竟是

14、Mg2+的拮抗作用所致，还是FK506的直接抑制作用所致，与Mg2+含量的升高只是一种反向伴随关系，有待进一步实验证实。 本实验中损伤后早期给予FK506只能缓解，而不能完全逆转损伤脊髓组织继发性水肿、Ca2+和Mg2+离子失衡等病理改变，主要是因为脊髓损伤是一个多环节的复杂过程，其治疗应结合药物，从各方面阻断损伤环节才能获得最大疗效。 另外，鉴于脊髓继发性水肿和钙超载的高峰期发生在伤后12小时，因此FK506治疗脊髓损伤的时间窗应控制在伤后12小时内，才能达到预期效果。 白藜芦醇对大鼠脊髓损伤后Ca2+，Mg2+-ATPase活性的影响J.钟，2002，25(12):882-885 .2Lo

15、pez Vales R，Garcia Atias G，Fores J，等. FK506减轻大鼠脊髓损伤后的组织损伤并预防功能障碍J.神经科学研究杂志，2005年，81(6):827-836。3Nito C，Kamiya T，上田M，等.亚低温增强FK506的神经保护作用并扩大其在大鼠短暂局灶性脑缺血后的治疗窗J.大脑研究，2004年，1008(2): 179-185。4麦克劳德先生，屠夫SP。一氧化氮合酶介导的新生大鼠小脑顶核环磷酸鸟苷的生成对钙调神经磷酸酶的抑制具有抗性J.神经科学列特，2002，322(1): 41-44。5Keswani SC，Rosenberg B，Hoke a . G

16、AP-43 mRNA定量在背根神经节培养中高通量筛选假定的神经保护剂中的应用J.欧洲科学方法杂志，2004，136(2): 193-195。6阿基诺M，奥东内尔JM，罗比塔耶PM，等.猪脊髓损伤的磷-31磁共振波谱研究。髓鞘变化，细胞内pH值和生物能学J.投资无线电，1997年，第32卷第7期:第382-388页。7范登贝赫、阿尔格拉、范库滕等人。硫酸镁治疗动脉瘤性蛛网膜下腔出血:一项随机对照试验j.中风，2005，36 (5): 1011-1015。8蔡，叶，谭，等.急性脊髓损伤后内皮素-1与钙离子关系的研究J.中国骨科杂志，2004，12 (20): 1568-1570。9佐伯H，松本M，金子S，等.鞘内注射硫酸镁对兔缺血性脊髓损伤安全吗J.Anesth Analg，2004，99(6):1805-1812。