临床医学论文-脊髓伤后脊髓组织一氧化氮合酶活性的动态变化及其意义.doc

1、 临床论文-脊髓损伤后脊髓组织一氧化氮合酶活性的动态变化及其意义摘要:目的探讨脊髓损伤后早期脊髓组织一氧化氮合酶活性的动态变化。 方法以损伤脊髓组织催化3h标记的精氨酸转化为3h标记的瓜氨酸的量，测定脊髓压迫损伤后0 0 60min损伤脊髓组织中nos的活性。 结果脊髓压迫损伤后，nos活性明显升高，伤后5min达到最高点。然后迅速下降，伤后1小时恢复到正常水平。 结论脊髓损伤后1小时内，损伤脊髓组织中nos活性迅速而短暂地升高。 一氧化氮(NO)是由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸(L-arg)产生的，在生物体内具有广泛多样的生物学效应，在生理状态下可传递信使和调节血管张力。病理状态下参

2、与脑缺血损伤，具有神经毒性1 然而，它在脊髓损伤中的作用仍不清楚。 由于no半衰期极短，难以直接测定，且不能在体内储存，因此本实验通过测定大鼠脊髓压迫损伤后nos活性的动态变化，间接反映了no的变化规律，有利于进一步探讨no与继发性脊髓损伤的关系。 材料与方法1.1实验动物及亚组42只健康封闭sd大鼠，体重(28030)g，随机分为假手术组和0、5、10、20、30、60min组，每组6只。 1.2试剂和设备l-2，3，4，5-3h-精氨酸、dowexag50w-x8、nadph、钙调素均购自sigma公司，其余试剂为国产ar级。 Megafuge1.0r低温离心机日本制造，beckmanls

3、5000ce液闪计数器美国制造，cps-1a超声粉碎机上海超声仪器厂制造。 1.3方法1.3.1动物模型的制备腹腔注射1%戊巴比妥钠30mg/kg麻醉动物，取后正中切口，切除T8 10椎板，暴露脊髓，nystrom法压迫脊髓2 (35.0g/10min)。 假手术组仅暴露脊髓，不造成损伤。 1.3.2脊髓标本的收集动物按分组时间要求处死后，立即浸入冰水中，将损伤脊髓或相应脊髓放入冷hepes缓冲液(20mmol/l，ph7.4)中，匀浆，超声粉碎。 立即在4低温离心机中离心(15000转/分钟，30分钟) 1 . 3 . 33h瓜氨酸检测将上述25ml上清液加入含2mmol/lnadph、0.

4、5mmol/lcacl2和10g/l钙调素的50mmol/lhepes缓冲液中，ph为7.4。 然后加入25ml3hl-精氨酸(25mci/25ml ),置于24恒温水浴中30分钟。 立即将其加入到含有2mmol/L ETA的20mmol/lhepes反应终止液中，通过dowexag色谱柱，在贝克曼液体闪烁计数器中测量3h-瓜氨酸的放射性。 1.3.4蛋白质含量的测定采用改良的lowry法3测定蛋白质含量。 1.3.5nos活性表示nos活性表示为每分钟每毫克蛋白质中形成的3h-瓜氨酸的量。 创伤后各时相的nos活性表示为与假手术组相比的相对值。 1.3.6统计处理采用f检验和t检验进行统计处

5、理。 结果脊髓压迫损伤后即刻，损伤脊髓组织的nos活性增加到正常脊髓的1.42倍，差异显著(P 原发性脊髓损伤后，引起一系列级联放大的生化变化，导致不可逆的继发性结构损伤。 现已发现许多因子参与了脊髓损伤后继发性损伤的过程，如兴奋性氨基酸、单胺类、神经肽、血小板活化因子等。 然而，逆转或停止这些因素的变化并不能有效阻止继发性脊髓损伤的发生。 这可能是由于脊髓创伤后继发性损伤的发生是一个涉及多种因素的复杂过程，对其病理生理过程的认识还不够深入，没有找到阻止其发生发展的根本环节。 近年来，人们认识到no是体内普遍存在的小分子物质，具有广泛多样的生物学效应。 为探讨其在脊髓损伤中的作用，根据nos催

6、化同位素标记的l-arg生成同位素标记的l-瓜氨酸和no的原理，首次动态观察了大鼠脊髓压迫损伤后nos活性的变化。 结果表明，脊髓压迫伤后nos活性迅速升高，伤后5min达到最高点，随后迅速下降，伤后60min恢复到正常水平。 脊髓压迫损伤后nos活性迅速而短期的升高，表明机体有调节nos活性的内在机制。但其调节的确切机制目前尚不清楚，可能涉及以下因素:(1)对缺血刺激的直接反应。 no的主要作用之一是调节血管张力，抗血小板粘附和聚集。 在脑组织中，no是调节血流的主要介质，脑缺血后结构性nos的活性迅速增加4 在脊髓组织中，no可能有同样的作用。当脊髓受到压迫时，导致缺血，需要大量的no来维

7、持局部的血液供应，达到内环境的稳定。 (2)结构性nos是一种钙依赖性酶，脊髓损伤可导致大量钙离子内流5 (3)一氧化氮合酶的磷酸化和去磷酸化 Bredt等发现脑nos有两组，可被不同的蛋白激酶磷酸化，导致nos活性降低6 脊髓创伤后缺血可迅速消耗atp，引起nos脱磷，也会导致nos激活。 (4)底物和辅因子对nos活性的影响 Nos催化底物l-arg与o2的反应，需要大量的还原性辅因子，如底物不足或辅因子缺失，都会影响反应。 脊髓损伤后，nos活性迅速升高，导致底物和辅因子大量消耗，导致nos活性下降。 (5)反应产物对nos活性的影响 No具有强氧化性，可使nos发生巯基亚硝酰化，从而使nos失活7 此外，no还可以氧化nmda受体中的关键巯基，从而减少钙内流和nos的活性8 脊髓损伤后早期nos活性迅速升高的意义尚不清楚。 一方面可能是对创伤和缺血刺激的反应。nos活性升高催化产生大量no，可扩张血管，抗血小板聚集，有利于改善缺血组织的血供。 但no是一种生物活性很强的自由基，可与多种组织成分发生反应，其大量快速产生会进一步损伤脊髓组织。