1、 临床论文-脂肪间充质干细胞的研究进展及临床前景【关键词】干细胞1引用目前干细胞的来源主要有两种，即胚胎干细胞(ESC)和成体干细胞(ASC)。 目前，各国对ESC研究普遍持谨慎态度，因为ESC涉及伦理和对其分化能力的控制。但ASC存在取材困难、获取率低(约1105个骨髓间充质细胞可获取一个间充质干细胞)1等缺点，其临床应用前景明显受限。 在这种情况下，人们从人脂肪组织抽吸物中获得了一种成纤维样细胞群2，它具有材料易得、获取率高、具有自我更新能力和类似ASC的多向分化潜能等优点。因此有望成为组织工程和基因工程中干细胞的新来源，具有良好的临床应用前景。 2 PLA细胞介绍2.1 PLA细胞的发现
2、近年来发现脂肪组织可以分泌多种激素样物质，可以调节机体的内分泌环境。脂肪组织不再是简单被动的能量储存场所，应该作为重要的内分泌器官来研究3 在干细胞研究中，发现越来越多的器官或组织存在分离的ASC，如神经干细胞、血液干细胞、骨髓间充质干细胞、肌肉干细胞、成体干细胞、皮肤干细胞4等。，而脂肪组织和骨髓组织一样，在胚胎发育过程中来源于中胚层，因此能否从脂肪组织中有效分离出干细胞成为研究目的。 2001年，Zuk等人2以手术切除或吸脂获得的人或大鼠的脂肪组织为研究对象。根据Katz等人的干细胞分离方法5，在消化和离心脂肪组织后，在显微镜下获得成纤维细胞形式的细胞群。在体外培养过程中，发现该细胞群增殖
3、效果稳定，老化程度低，可分化为多种细胞类型。与干细胞的独特特性一致，如多向分化潜能和自我复制能力，因此被命名为processde脂肪抽吸细胞(PLA细胞)。 原代培养时贴壁细胞少，传代后的细胞称为脂肪干细胞。 2.2形态及生长特征ADAS细胞平行排列，生长如漩涡状，细胞呈梭形，胞质和核仁丰富。 在继代培养中，经过几次继代培养(10 20代)，细胞增殖速度没有明显减慢，老化和死亡细胞的比例很小。 这表明脂肪组织中富含ADAS细胞，且该细胞体外扩增能力强，易于传代培养6 2.3通过流式细胞术和免疫组织化学进行的免疫表型研究显示，体外培养的ADAS细胞可以表达以下蛋白质 a)粘附分子:ADAS细胞始
4、终表达四跨蛋白(CD9)、整合素1(CD29)和4(CD49D)；细胞间粘附分子1 (ICAM 1，CD54)、内皮生长因子(cd102)、血管细胞粘附分子(VCAM，CD106)和活化淋巴细胞粘附分子(ALCAM，CD166)。 但不表达神经细胞粘附分子(NCAM，CD56)、细胞间粘附分子3 (ICAM3，CD50)、整合素b(CD11b)、2(CD18)和内皮选择蛋白(E-选择素，CD62)。b)分子受体:可以表达透明质酸盐(CD44)和转铁蛋白(CD71)的受体；c)细胞外基质蛋白和糖蛋白:ADAS细胞能产生型胶原、骨桥蛋白、骨连接蛋白、Thy-1(CD90)和muc 18(CD 14
5、6)；d)肌球蛋白:能在平滑肌细胞中表达肌动蛋白和波形蛋白；e)造血细胞标记:没有造血细胞标记CD14、CD31或CD45被表达出来；f)补体调节蛋白:确认其能表达衰变加速因子(CD55)和补体蛋白；g)组织相容性抗原:表达组织相容性样蛋白HLA-ABC，但不表达HLA-DR 不同实验的结果是不同的，但这种差异可能是由于细胞分离、培养和纯化的方法不同，以及免疫组化和流式细胞仪的灵敏度不同造成的。 总的来说，PAL细胞的免疫表型与已报道的骨髓间充质干细胞相似7 2.4 PLA细胞与间充质干细胞(MSC)的比较脂肪组织和骨髓来源于胚胎发育过程中的中胚层。因此，有学者将PLA细胞与骨髓来源的MSC在
6、细胞形态、生长动力学、多向分化能力、细胞衰老等方面进行了比较，发现两者的差异仅在以下几个方面8: a)来源和获取方式。 需要MSC骨髓穿刺，密度梯度离心获得，量少；而PLA细胞来自脂肪组织抽吸物，简单消化离心即可获得，且量大。b)细胞表面抗原 与MSC PLA细胞在细胞表面表达的CD抗原大体一致，但表达的细胞粘附分子略有不同9。c)体外培养模式 MSC体外培养时，血清的质量和来源对其生长增殖有很大影响10，而PLA细胞体外增殖分化不需要添加特殊的血清。 聚乳酸细胞的多向分化潜能获得和分化聚乳酸细胞的方法简单易行。 在通过手术或吸脂术获得脂肪组织后，根据Katz等人5获得PLA细胞。整个分离过程
7、只用了2个小时，得到的量很大。一般300 mL吸脂获得2106 6106个PLA细胞。 实现PLA细胞定向分化的基本培养基是Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM)，针对不同的定向分化需要添加不同的刺激因子。 3.1向软骨细胞的分化在培养基中加入转化生长因子(TGF-)、Vc和地塞米松后，人ADAS细胞可以展示与成熟软骨细胞相关的生化标志物。 在与合适的三维支架一起培养1 2周后，ADAS细胞可以分泌软骨细胞的细胞外基质蛋白、胶原、和聚焦蛋白聚糖11 3.2分化为成骨细胞的人和小鼠ADAS细胞在含有Vc、B甘油磷酸、地塞米松和1.25 VD3的培养基中培养2 4周后，可在细胞外基质
8、中形成磷酸盐钙化沉积，并表达成骨基因和蛋白(包括碱性磷酸酶、成骨蛋白和骨钙素、骨桥蛋白和骨桥蛋白受体)。 将ADAS细胞包埋在由羟基磷灰石/磷酸三钙组成的多渗透水立方中，并植入免疫缺陷小鼠体内。6周后，可以从ADAS细胞产生新的类骨组织。 而且在相同的实验条件下，比骨髓间充质干细胞能产生更多的骨祖细胞和细胞外钙化基质成分12 3.3分化为肌细胞3.3.1分化为骨骼肌细胞在添加马血清的培养基中，人ADAS细胞能表达myoD、肌生成素和骨骼肌转录调节因子。 最后，细胞融合形成多核肌管，并表达骨骼肌细胞谱系的标记蛋白，如肌球蛋白轻链激酶13 3.3.2在心肌细胞分化培养基中加入5氮胞苷诱导培养一周后
9、，ADAS细胞形态发生变化，两周后细胞变圆，三周后细胞自发搏动并表达心肌细胞特异性蛋白肌钙蛋白I14 形态学、免疫组化和超微结构分析表明，分化细胞具有心室样细胞和心房样细胞的特征。 3.3.3分化为平滑肌细胞由于人ADAS细胞在体外表达一种平滑肌肌动蛋白，提示其具有修复胃肠道或尿道平滑肌损伤的价值。 事实上，外科医生已经开始探索其临床应用的可能性。 Garcai等人移植自体人ADAS细胞修复克罗恩病引起的直肠阴道瘘，观察到瘘愈合良好15，表明自体ADAS细胞可能成为一种有价值的外科治疗方法。 3.4体外分化为脂肪细胞的实验表明，人ADAS细胞可以回到原来的分化途径，形成脂肪组织。 包括胰岛素、
10、甲基异丁基黄嘌呤(一种能提高CAMP水平的磷酸二酯酶抑制剂)、氢化可的松或地塞米松、吲哚美辛或噻唑烷二酮(一种能激活C配体的过氧化物酶增强剂)、泛酸、生物素和三碘甲状腺原氨酸。 7 10天后，用油红0或尼罗红染色。 发现ADAS细胞充满含有中性脂滴的囊泡，充满脂肪酸结合蛋白aP2和脂蛋白脂肪酶，并分泌脂蛋白瘦素16 将已分化或未分化的ADAS细胞注射到不同生物材料的各种动物模型(大鼠、猪)中，如藻酸盐、透明质酸、纤维蛋白胶、聚乳酸等。，可以形成脂肪。 而且，使用多孔生物材料可以提高脂肪形成的能力17 3.5 ADAS细胞分化为内皮在半固体培养基中，小鼠ADAS细胞可被诱导分化为内皮细胞。这些细
11、胞表现出同种异体细胞CD34 +和CD13+的特征，并自发表达内皮细胞表面标记物CD31和血管性血友病因子(血管性血友病因子) 将ADAS细胞移植到裸鼠体内可以促进裸鼠缺血组织中新血管的形成以及基质胶层上血管样组织结构的出现18 3.6 ADAS细胞与造血人ADAS细胞可以表达一些与骨髓间充质干细胞分化为造血细胞时表达的粘附蛋白相同的粘附蛋白。 此外，ADAS细胞还分泌多种细胞因子，包括M-CSF、GM-CSF、TNFa、IL-6、IL-7、IL-8、IL-11和干细胞生长因子。 当与CD34+造血干细胞共培养时，人ADAS细胞可以扩增CD34+细胞并促进其向T和B细胞分化19 3.7经皮分化
12、的神经细胞来源于外胚层。 在无血清培养基中，人和小鼠的ADAS细胞表现出类似神经细胞的双突起状，还表达神经细胞相关蛋白:巢蛋白、中间丝M和NeuN以及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。 当培养基中加入吲哚美辛、胰岛素和丁基化羟基茴香醚时，ADAS细胞可以产生类似的变化。 杜克大学的Safford等人发现大鼠ADAS细胞在诱导剂的作用下分化为神经元和胶质细胞，这进一步证实了这些新细胞也具有类似神经细胞的功能20 这些都表明ADAS细胞可以分化为外胚层细胞。 4临床前景组织或器官缺损性疾病、退行性疾病、遗传性疾病是临床上治愈率极低的疑难杂症。试图通过组织工程技术将组织来源的干细胞在体外扩增、诱导成需要
13、的细胞，然后植入体内，从而解决这一系列临床难题，已成为研究热点。 PLA细胞因其自身来源、免疫力低、易获取、细胞丰富、多向分化等特点，有可能成为一种优势的基因治疗载体。 目前已证实来源于人脂肪抽吸物的PLA细胞在不同细胞因子和激素条件下可转化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞等，近期研究发现大鼠脂肪组织中的PLA细胞可能更具有定向分化的潜力。 同时，Morizono的报告证实，PLA细胞经腺病毒或慢病毒转染并分化为脂肪细胞或成骨细胞后，仍能稳定表达外源基因，提示与病毒结合的PLA细胞可作为基因治疗的载体表达外源基因。 虽然在PLA细胞的实际应用中还存在一些亟待解决的问题，如体外培养是一个优化
14、的环境，体外培养的PLA细胞能否适应内部环境并继续生长分化；能否排除体内控制PLA细胞分化过程中的致瘤风险和免疫紊乱，但相信对PLA细胞的研究仍有广阔前景，脂肪组织来源的PLA细胞很可能取代目前的干细胞来源，成为未来组织工程和基因治疗的新热点，并能解决一系列临床难题，具有良好的应用前景。 【参考文献】1皮滕格尔，马凯，贝克，等.成人骨髓间充质细胞的多系年龄潜能J.科学, 1999，284(5411):143-147。2朱克帕，朱敏，水野彩香，等.人脂肪组织来源的多向分化细胞及其在细胞治疗中的应用J.组织工程，2001，7(2):211-228。3黄克诚，Loftus TM，Mandrup S，
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