临床医学论文-脂联素基因单核苷酸多态性与2型糖尿病的相关性研究.doc

1、临床论文脂联素基因单核苷酸多态性与二型糖尿病的关系研究摘要目的探讨脂联素基因H241P突变与二型糖尿病的关系方法随机抽取吉林省延边地区无血缘关系的朝鲜族和汉族人群377人，其中糖耐量正常195人，二型糖尿病182人。进行口服葡萄糖耐量试验，并在实验前和实验后2小时检测血糖。采用体重指数和腰臀比评价体脂含量和分布。聚合酶链反应单链构象多态性分析apM1基因突变，并对异常带型样本进行基因序列测定。结果研究对象中发现1例脂联素基因H241P突变，属于二型糖尿病群体。结论脂联素基因H241P突变可能不是二型糖尿病的易感因素。【关键词】脂联素基因多态性与二型糖尿病糖尿病的关系摘要:目的探讨脂联素基因H2

2、41P突变与二型糖尿病(T2DM)的关系。方法研究人群为吉林省延边地区汉族和朝鲜族居民377人，其中糖耐量正常(NGT)195人，T2DM 182人。口服葡萄糖耐量试验时，分别在0和2h测定血糖。体脂含量和分布用体重指数(身体质量指数)和腰臀比(WHR)来评价。应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)对apM1基因进行突变筛查，然后用自动DNA直接测序技术检测确切突变。结果在1例T2DM患者中发现H241P突变，突变率为0.5%。结论apM1基因的H241P突变不是T2DM病的易感基因。关键词:糖尿病，2型；脂联素；突变脂肪组织不仅是能量储存组织，也是控制能量平衡的内分泌器官。当代

3、谢状态发生变化并受到外界因素刺激时，可分泌多种具有生理活性的蛋白质脂肪细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNF-)、瘦素、抵抗素和脂联素(脂联素基因转录物1，ApM1)等，apM1参与糖和脂肪代谢的调节，增加胰岛素敏感性，具有抗炎和抗动脉硬化作用。研究结果表明，在胰岛素抵抗状态下，体内apM1水平与胰岛素敏感性呈正相关，而二型糖尿病、肥胖和冠心病患者血液中apM1水平下降1。提示apM1与代谢综合征的发生密切相关。本研究从遗传变异的角度探讨了apM1与二型糖尿病发生的相关性1对象与方法1.1研究对象的选择与分组所有被调查者均为吉林省延边地区的朝鲜族和汉族，互无血缘关系，且父母连续三代为同一民族，人群相

4、对稳定。根据知情自愿原则，按照1997年美国糖尿病协会(ADA)的诊断和分类标准，将其分为两组:糖耐量正常组和二型糖尿病组。糖耐量正常组195人，其中朝鲜族97人，汉族98人。年龄从39岁到60岁不等，平均51岁。男性92人，其中汉族49人，朝鲜族43人，女性103人，其中汉族51人，朝鲜族52人。二型糖尿病患者182例，其中朝鲜族90例，汉族92例。年龄从40岁到61岁不等，平均52岁。男性79人，其中汉族40人，朝鲜族39人，女性103人，汉族51人，朝鲜族52人。两组在民族、年龄、性别比例上无显著差异，具有可比性。1.2试剂琼脂糖、PCR引物、PCR标记物、PCR反应试剂均为美国Prom

5、ega公司产品；溴化乙锭是Amresco公司的产品；DNA提取试剂盒为上海华顺生物工程有限公司/上海华药核酸科技有限公司产品1.3方法1.3.1生化指标和体脂含量及分布测定空腹过夜10小时后，进行口服葡萄糖耐量试验，实验开始时和2小时后取静脉血10mL，测定葡萄糖(氧化酶法)、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇。同时测量身高和体重，计算体重指数和腰臀比，估计体脂含量和分布。1.3.2 DNA提取和PCR扩增取每个研究对象外周血1mL，置于ACD抗凝管中，保存于-20备用。用少量基因组DNA提取试剂盒制备基因组DNA，4保存，紫外分光光度计测定OD值。结果在260280n

6、m波长范围内OD值大于1.6，表明DNA纯度较好，质量浓度在200 mg/L以上；从基因库中查询人apM-1基因序列，用Primer3软件进行在线引物设计。合成片段长度为394bp，上游引物为5gag ga CAA GGC TAT gctc 3，下游引物为5gag GAC TGG GAA cat AGC。镁离子2l；dNTP 1L；上游和下游引物各1l；Taq酶5u；DNA模板300ng；用双蒸水加至50L，高速离心一会儿(4)，混匀样品，放入PCR(PTC 100)热循环仪中扩增。扩增参数:95预变性5min，95变性1min，59退火45s，72延伸30s，30个循环后72延伸7 min。

7、PCR产物通过了10 g/L，在紫外灯下检测扩增结果(图1)。1.3.3单链构象多态性(SSCP)分析和DNA序列测定制备55g/L聚丙烯酰胺凝胶，取10L PCR产物，加入10L甲酰胺变性剂，98水浴7min，取出后立即冰浴2min，取10L样品，在4室温120V电压下电泳5h。100mL/L乙醇固定5min，蒸馏水漂洗2次，100mL/L硝酸浸泡脱色10分钟，蒸馏水洗涤2次，2g/L硝酸银染色25分钟，蒸馏水洗涤3 5次，含0.3g/L甲醛的15g/L碳酸钠显色。当可见条带时，用100g/L冰醋酸终止反应，用蒸馏水冲洗，干凝胶拍照，纯化有异常条带的PCR产物，测定基因序列。2结果2.1 P

8、CR SSCP分析和基因序列测定在377例受试者的PCR扩增结果的SSCP分析中发现1例异常条带(图2)。序列分析显示，apM1 +722bp(以腺嘌呤为起始密码子+1)处存在A/C杂合突变，密码子由CAT(His，H)变为CCT(Pro，P)，导致H241P的错义突变(图3)。2.2 H241P突变与临床变量的关系。研究对象为二型糖尿病汉族女性，突变频率为0.5%(表1)，体重指数为26.1，腰臀比为0.92，血压和甘油三酯值均高于正常值。表1正常糖耐量组和二型糖尿病组apM1基因H241P基因型和等位基因分布3讨论apM1是舍雷尔等在1995年发现的脂肪组织特异性胶原样细胞因子，也称为Ac

9、rp30。AdipoQ，GBP28，是一种血浆激素蛋白2。人类apM1基因是单拷贝基因3，全基因组扫描显示其位于染色体3q27上，二型糖尿病和代谢综合征的易感位点也位于3q27上4。apm1基因长约17kb，由三个外显子和两个内含子组成5，其编码序列从外显子2开始。在启动子区没有发现TATA盒。apM1由244个氨基酸组成，相对分子量为28ku，包括氨基端的分泌信号序列、一个小的非螺旋区、一段22个胶原样重复序列和羧基端的球形结构，羧基端是APM1的主要功能位点，H241P突变所在。日语中还有一个H241P突变，法语中没有6可见H241P突变具有种族异质性。本研究采用PCR-SSCP技术检测延

10、边地区朝鲜族和汉族人群apM1基因H241P突变。结果显示，二型糖尿病病组和糖耐量正常组之间的频率没有显著差异，表明H241P突变可能与二型糖尿病没有显著相关性。总之，apM1基因H241P突变可能不是二型糖尿病的易感因素。参考文献 1魏耶C，付娜哈希特，田中S，等.肥胖和二型糖尿病患者的低脂联素血症:与胰岛素抵抗和高胰岛素血症密切相关J.中华内分泌代谢杂志，2001，86:1930。2舍雷尔佩，威廉S，福利亚诺M等.一种新的C1q血清蛋白，仅在脂肪细胞中产生J。生物化学杂志，1995年，270:26746。3 Saito K，Tobe T，Minoshima S，等.明胶结合蛋白(GBP28)基因的组织J.基因，1999，229(1-20):67。4基塞巴阿，索南伯格格，米克尔巴斯特J，等.3号和17号染色体上的数量性状位点影响代谢综合征的表型J.美国国家科学院学报，2000年，97:14478。5高桥M，有田Y，山形K，等.脂肪特异性基因脂联素的基因组结构与突变J.国际期刊，相关代谢疾病，2000年，24:861。6瓦瑟尔F赫尔贝克N迪娜C等.APM1基因近端启动子和外显子3的单核苷酸多态性单体型调节脂肪细胞分泌的脂联素激素水平，并导致法国白种人二型糖尿病病的遗传风险J。人类分子遗传学，2002，11:2607