临床医学论文-脂氧合酶抑制剂NDGA对乳腺癌MCF.doc

1、 临床论文脂肪氧合酶抑制剂NDGA对乳腺癌MCF7摘要目的:探讨NDGA对乳腺癌MCF7细胞VEGF和CD44V6表达的影响。 方法:将乳腺癌MCF7细胞株培养至对数生长期，用0、1、10、100 m ol/L NDGA处理48h，用RTPCR检测VEGFmRNA的表达水平，用流式细胞仪检测CD44V6的表达。 结果:三组VEGFmRNA和CD44V6的表达均明显低于对照组(F = 2996.13，P 0.001F=3435.08，P0.001) 结论:NDGA显著下调MCF7细胞VEGFmRNA和CD44V6的表达，抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。 【关键词】乳腺肿瘤脂肪氧合酶抑制剂CD 44 V

2、6 VEGF lip氧抑制剂(NDGA)对乳腺癌MCF7细胞VEGF和CD44V6表达的影响【摘要】目的:探讨NDGA对乳腺癌MCF 7细胞VEGF和cd44v 6的影响。方法:选择对数生长期的MCF7细胞并进行测量。实验分为四个细胞组(浓度:0，1，10，100mol/L)。NDGA处理48h后，RTPCR检测VEGFmRNA的表达，流式细胞仪检测CD44V6的表达。结果:经NDGA治疗后，NDGA组VEGFmRNA和CD44V6的表达明显低于对照组(F=2996.13，P 0.001F=3435.08，P0.001)。结论:NDGA可能通过下调VEGFmRNA和CD44V6的表达来影响MC

3、F7细胞的侵袭和转移。【关键词】乳腺脂肪氧合酶抑制剂CD 44V6 VEGF NDGA(去甲二氢愈创木酸)能通过脂肪氧合酶途径抑制花生四烯酸的代谢，是一种强脂肪氧合酶抑制剂。据报道，NDGA诱导结肠癌细胞凋亡1 我们发现NDGA可以通过下调MCF7细胞中端粒酶hTERTmRNA和bcl2-2的表达来抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡2 本文以VEGF和CD44V6为侵袭和转移指标，探讨NDGA对乳腺癌MCF7细胞侵袭和转移的影响。 材料和方法1.1细胞株和材料乳腺癌细胞株MCF7由山东大学细胞生物学教研室提供。 VEGF引物序列:上游引物5ttgcttctcttctcccctcacc 3和下游引物5a

4、atgctttctcttctctcgctcc 3的扩增片段长度为418bp。 以肌动蛋白为内参:上游引物5gtggggcgcccggcacca 3和下游引物5ctctttaatgtcacgcacgatttc 3的扩增片段长度为539bp。 上述引物由上海博雅生物工程有限公司合成 RNA提取试剂盒、dNTP、RNA酶、MMLV逆转录酶和TaqDNA聚合酶均购自上海龚升生物公司。 1.2方法1.2.1细胞培养和处理MCF7细胞在含10%小牛血清、青霉素和链霉素浓度为100U/ml、碳酸氢钠浓度为2g/L的RPMI1640培养基中培养，置于37、含5%CO2的湿润培养箱中，在25cm2/50ml的一

5、次性塑料培养瓶中传代培养。 NDGA处理组的浓度分别为0、1、10和100mol/L，共4组。 对数生长期80%90%且充满瓶底的MCF7细胞用0.25%胰蛋白酶消化，待细胞形状变圆，体积变小后，倒出胰蛋白酶，加入含血清的培养液停止消化，轻轻吹制成单细胞悬液，分装于数个培养瓶中。取出四组生长良好的细胞，倒出培养液。各处理组的NDGA浓度分别为1和1。 继续培养48小时，消化离心收集待检样品。 1.2.2通过rt-PCR分析VEGFmRNA表达。用不同浓度的NDGA处理48小时的细胞和未处理的细胞被消化并离心(1000r/m，5min)，用PBS洗涤并再次离心，弃去上清液，收集的细胞保存在-80

6、备用。 异硫氰酸胍一步提取总RNA，然后进行逆转录反应和PCR反应。对凝胶电泳结果进行定量分析，并计算相关系数。 相对系数=VEGFmRNA表达强度/肌动蛋白表达强度 根据相关系数，通过统计分析和直方图计算出VEGFmRNA的抑制率=(对照组-治疗组)/对照组100%。 1.2.3流式细胞仪检测CD44V6表达。用NDGA处理48小时且未用各种浓度处理的单细胞悬液在离心管(1500转/分钟，5分钟)中离心，用PBS冲洗，离心5分钟，弃去上清液。然后，在EP管中加入2ml 70%冷乙醇，并在4固定。 调节细胞悬液浓度至106107/ml，取两个试管，分别加入500l待测细胞悬液，一个试管加入20

7、l单克隆抗体CD44V6FITC工作液，另一个试管加入20l阴性对照单克隆抗体IgG1FITC工作液，室温避光205分钟，2000r/min离心5分钟，弃去上清液，加入PBS500l，在 1.3统计处理定量数据用xs表示，用SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析(Dunnett t检验)，p 0.05为有统计学意义。 2.结果2.1 VEGFmRNA表达MCF7细胞经NDGA处理48小时，各处理组与对照组比较差异有统计学意义(f = 2996.13，P 0.001)，说明NDGA抑制了细胞中VEGFmRNA的表达，且存在一定的剂量依赖关系(表1，图1)。 内参actin显示扩增片段长度为5

8、39bp，宽度和深度相同，而VEGFmRNA显示扩增片段长度为418bp，宽度和深度不同。 随着NDGA浓度的增加，VEGF的条带逐渐变窄和变浅，表明VEGFmRNA的表达被NDGA抑制并逐渐减少(图2) 表1 NDGA对MCF7细胞VEGFmRNA表达的影响(略)2.2 CD44V6的表达NDGA对MCF7细胞处理48小时后，各处理组与对照组之间有统计学显著差异(f = 3435.08，P 0.001)，说明1100mol/L的NDGA抑制cd44v 6(表2和图3) 相关分析表明，CD44V6与NDGA浓度的相关系数为-0.581，P值为0.018 0.05，具有显著性。因此，我们可以认为

9、CD44V6与NDGA浓度呈负线性相关，NDGA浓度越高，对CD44V6的抑制作用越强，呈剂量依赖关系。 表2 NDGA对MCF7细胞CD44V6的影响(略)3关于血管生成的讨论血管生成是恶性肿瘤组织侵袭的重要基础，而血管内皮细胞的增殖是血管生成过程中最基本的环节，受多种细胞外信号因子的调控。目前已知有多种血管生成因子参与诱导和调节肿瘤新生血管的形成，其中以VEGF的关系最为密切，最具代表性3 抑制VEGF表达可能是NDGA抗肿瘤的机制之一。 有证据表明，血管生成抑制剂具有抗转移作用4 Mario等研究表明，NDGA可以显著下调人恶性胸膜间皮细胞VEGFmRNA的表达，同时减少VEGF蛋白的产

10、生，阻断细胞增殖，诱导细胞凋亡5 我们的实验结果表明，MCF7细胞中VEGFmRNA高表达。NDGA处理后，VEGFmRNA的表达水平明显降低，并呈剂量依赖性，这表明NDGA对MCF7细胞中VEGF表达的抑制至少在转录水平。 由于VEGF基因最终是通过蛋白质发挥作用的，在转录和翻译的过程中有多层次的调控，所以不能简单地断定VEGFmRNA和VEGF蛋白的产生有因果关系，需要进一步的研究和探讨。 VEGF主要通过两种酪氨酸激酶受体(VEGFR1和VEGFR2)调节内皮细胞的信号。 VEGFR2与内皮细胞的分化和增殖密切相关，是血管生成过程中的主要调节因子6 VEGF与受体结合后，酪氨酸激酶被激活

11、，血管内皮细胞增殖生长，形成新内膜，为肿瘤细胞的生长提供必要的营养。 如果能有效抑制VEGF及其受体的表达，将对抑制内皮细胞增殖和肿瘤血管生成具有重要意义。 Colavitti等7发现VEGF与内皮细胞膜表面的受体VEGFR2结合后，通过受体的磷酸化激活下游信号传递系统的启动子，诱导内皮细胞线粒体内活性氧的产生，有利于线粒体呼吸链的传递，促进细胞分裂增殖，而脂氧合酶抑制剂NDGA可显著减少活性氧的产生，其机制可能是通过抑制细胞膜上VEGFR2的磷酸化实现的。 据报道8，NDGA能有效抑制内皮细胞和胶质瘤细胞诱导的内皮细胞增殖和迁移，同时降低内皮细胞中VEGFR2的表达水平，这可能是NDGA抗血

12、管生成的重要分子基础。 细胞表面分子CD44V6是一种细胞粘附因子，与细胞的迁移和运动有关，在肿瘤的生长和转移中起重要作用9 研究表明，CD44V6在正常导管和腺泡上皮细胞中的表达为阴性。从正常组织、导管内乳头状瘤、乳头状瘤癌变、导管内癌、浸润性导管癌上皮细胞到癌细胞，CD44V6的表达强度和阳性率均呈上升趋势10 结果显示，正常对照组MCF7细胞中CD44V6的荧光强度为134.4111.88，阳性细胞数为50.351.68%，说明MCF7细胞中有CD44V6表达，但表达水平随着NDGA浓度的增加而逐渐降低，并呈剂量依赖关系。 这说明NDGA可以下调乳腺癌MCF7细胞中CD44V6的表达水平

13、，抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。 在以前的研究中，我们发现11，NDGA抑制MCF7细胞表面的超微结构，从而降低细胞与细胞外基质的粘附性和细胞的流动性。NDGA是否下调CD44V6的表达，影响细胞内细胞骨架蛋白的构象和分布，进而影响肿瘤细胞的流动性，促进肿瘤转移的发生，还有待进一步研究和探讨。 1夏光涛，张，吴森森，等.脂氧合酶抑制剂诱导HT2P结肠癌细胞凋亡的研究J.中国现代普通外科进展，2006，9 (1): 2729。2刘焕涛，孙，唐.脂氧合酶抑制剂NDGA对乳腺癌MCF7细胞端粒酶和bcl2-2的影响J.中国现代普通外科进展，2005，8 (6): 358，360。3 Lundel，Spa

14、ng TM，Skovgaard PH等。肿瘤血管生成:胶质瘤治疗的新靶点J.神经扫描学报，1998，97 (1): 5262。4陈。血管内皮生长因子和血管内皮生长因子受体3在乳腺癌淋巴转移中的作用J.中国现代普通外科进展，2005，8(2):6971。5Mario R，Alfonso C，Michele N，等. 5脂氧合酶调节恶性间皮细胞存活:血管内皮生长因子的参与J.FASEB J，2001，15:23262336。6诺尔JE，Christensen J，Mooney DJ，等. VEGF介导的血管生成与内皮细胞存活增加和bcl2表达诱导有关J.美国病理学杂志，1999年，第154卷第2期

15、:375384页。7Colavitti R、Pani G、Bedogni B等。活性氧通过VEGFR 2/KDR作为情绪信号的下游介质j.生物化学杂志，2002，277 (5): 31013108。8孙，陈宜生，石景全，等.去甲二氢愈创木酸对血管内皮生长因子及其受体KDR基因表达影响的研究J.第三军医大学学报，2001，23 (3): 268271。9 Tranta，Kallakury BV，Sheehan SB等。CD44标准形式和变异形式在非小细胞肺癌中的表达j.哼pathol，1997，28: 809814。10何杰华，梁晓曼，侯景辉J.癌症，2002，21 (6): 615618。11刘焕涛，孙，马蓉，等.脂肪氧合酶抑制剂对乳腺癌细胞MCF7增殖和凋亡的影响J.中国实验外科杂志，2005，22