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    临床医学论文-胸腔积液中腺癌细胞甲状腺转录因子1表达的定量研究.doc

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    临床医学论文-胸腔积液中腺癌细胞甲状腺转录因子1表达的定量研究.doc

    1、 临床论文胸腔积液腺癌细胞甲状腺转录因子1表达的定量研究目的分析胸腔积液腺癌细胞甲状腺转录因子1 (TTF 1)的表达特点和规律,从定量角度探讨其作为判断胸腔积液转移性肺腺癌组织来源指标的临床应用价值。 方法选择胸腔积液转移性腺癌48例,其中肺腺癌37例,非肺腺癌11例。 每例均制备巴氏染色细胞涂片和石蜡包埋细胞石蜡切片,并对相应的细胞石蜡切片进行he和TTF-1免疫组织化学染色。 结果37例肺腺癌中有28例表达TTF 1,11例肺外腺癌中无TTF 1表达。 水中肺源性性腺癌细胞与非肺源性性腺癌细胞的TTF1PU值有显著差异(P 定量结果显示,胸腔积液中肺源性性腺癌细胞和非肺源性性腺癌细胞的T

    2、TF 1的PU值的频率分布没有重叠。PU值大于8作为肺源性性腺癌细胞的诊断阈值,PU值小于6作为非肺源性性腺癌细胞的诊断阈值。诊断试验结果表明,TTF 1诊断癌性胸腔积液中肺腺癌细胞的敏感性为75.7%,特异性为100%。 标准化阳性预测值为100%,标准化阴性预测值为80.43%,标准化准确率为87.84%。 结论在排除甲状腺癌的可能性后,TTF 1作为胸腔积液细胞石蜡标本中肺腺癌细胞的诊断标志物具有较高的特异性和敏感性,胸腔积液腺癌细胞中TTF 1的PU值可作为判断肺源性和非肺源性性腺癌细胞的特异性诊断指标。 【关键词】胸腔积液;甲状腺转录因子1;肺腺癌;免疫组织化学;定量摘要:目的通过对

    3、胸腔积液腺癌细胞中甲状腺转录因子1 (TTF 1)的定量分析,探讨TTF 1作为肺腺癌转移标志物的临床价值。方法48例恶性胸膜转移腺癌,其中37例来自肺,11例来自肺外。对这些病例的胸腔积液标本制备巴氏染色涂片和细胞块,并对细胞块切片进行TTF-1免疫组化检测。结果TTF-1在28例肺腺癌中表达,11例肺外腺癌中无表达。肺腺癌中TTF-1阳性单位(PU)大于肺外腺癌,两者有显著性差异(p 肺腺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌等癌细胞均可通过转移出现在胸腔积液中,以肺腺癌最为常见1 很多恶性肿瘤患者以胸腔积液为首发症状,临床检查很难发现原发病灶。 由于各种转移性腺癌的细胞形态相似,仅通过细胞学检查难以确

    4、定其组织来源,判断胸腔积液中转移性腺癌的原发部位对临床诊断和治疗具有重要意义。 因此,胸腔积液中腺癌细胞的来源是胸腔积液细胞病理学研究中需要解决的重要问题。 甲状腺转录因子1 (TTF 1)是近年来发现的一种新的分子标记,位于人类染色体14q13上,是NKX2转录因子家族的成员,是一种相对分子量为38 kDa的核转录蛋白。 TTF-1表达于肺和甲状腺的上皮细胞、邻近甲状腺滤泡的C细胞和胚胎脑的某些区域,而不表达于肝脏、胃肠道、乳腺、肾脏和前列腺等其他部位的上皮细胞和间皮细胞24 因此,本研究通过定量检测恶性胸腔积液不同组织中转移性腺癌细胞TTF 1的表达,探讨TTF 1作为胸腔积液转移性肺腺癌

    5、细胞标志物的临床应用价值。 材料与方法1.1标本收集收集南方医院2006年6月至2007年2月48例癌性胸腔积液,其中肺腺癌37例,胃癌4例,乳腺癌3例,卵巢癌2例,子宫内膜癌1例,结肠癌1例。 每个病例通过组织学、细胞学或临床资料进行诊断。平行制备巴氏染色涂片和石蜡包埋细胞蜡块。 1.2细胞蜡块的制备:取10 ml胸腔积液,3000 rpm,室温离心10 min,弃去上清液,加入8ml 95%乙醇,3000 rpm离心10 min,室温静置2 h,弃去上清液,加入10%中性福尔马林固定3 h,然后放入脱水箱,常规石蜡包埋,制备蜡块。 1.3免疫组化染色采用鼠抗人TTF1单克隆抗体,免疫组化S

    6、P法,TTF1抗体工作液浓度为1100。 将细胞蜡块连续切片(约3 4 um厚)并贴在许多用赖氨酸处理过的载玻片上。 切片在65烘箱中烘烤3 h,常规脱蜡和梯度乙醇水合。 1 mmol/L,PH6.0柠檬酸微波修复抗原15 min 3% H2O2在室温下作用10分钟以去除内源过氧化物酶,并用蒸馏水洗涤3次。 加入未免疫的山羊血清,在室温下孵育15分钟。 加入鼠抗人TTF-1单克隆抗体,4过夜孵育12 h,用PBS漂洗4次,每次3 min。 加入生物素标记的羊抗鼠二抗,室温孵育10分钟,用PBS漂洗3次,每次3分钟。 加入链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液,室温孵育10分钟,用PBS冲洗3次,每

    7、次3分钟。 在显微镜下控制DAB显色时间 用于定量检测的免疫组织化学染色切片不再染色,DAB显色时间为5 min。 对染色结果可疑的人重复该实验。 用PBS代替一抗作为空白对照,肌肉组织作为阴性对照,甲状腺组织作为阳性对照。 1.4 TTF 1蛋白表达的定量分析根据空白、阳性和阴性对照的显色情况,在不存在假阳性和假阴性的前提下,将细胞核染成棕色或棕褐色为阳性。 使用徕卡Q500 MC图像分析系统,在40倍物镜下从每个样品中随机选取20个视野作为该样品的测试区域。 在每个视野中随机测试10个阳性细胞,在每种情况下测试200个阳性细胞。用交互测试法测试每个阳性细胞核的灰度值G,在相应的20个视野内

    8、测试背景灰度值G并取其平均值。按照文献方法计算每个阳性细胞核的阳性单位(PU),取每例200个阳性细胞的平均PU作为本例的阳性单位5 7 1.5统计分析采用SPSS10.0统计分析软件对两组计量数据进行卡方检验和t检验,计量数据以均数标准差(S)表示。 结果2.1转移性性腺癌细胞在胸腔积液中的形态特征37例转移性肺腺癌患者的胸腔积液细胞巴氏染色涂片,肿瘤细胞呈团簇状或散在分布,细胞体积增大,胞质内可见粘液空泡,细胞核增大、偏移,具有明显的异型性(图1)。 在细胞蜡块中he染色的切片中,肿瘤细胞排列成腺腔样结构(图2),这些细胞学表现缺乏组织特异性。 2.2转移性性腺癌细胞TTF1在胸腔积液中的

    9、表达2.2.1转移性性腺癌细胞的TTF1免疫组织化学染色结果见表1。 肿瘤中TTF-1基因编码蛋白产物的测定图1胸腔积液中转移性性腺癌细胞(离心涂片,巴斯德染色,客观放大40倍)图2胸腔积液中转移性腺癌(细胞蜡切片,HE染色,客观放大40倍)位于细胞核内,呈棕黄色(图3) 在37例肺腺癌胸腔积液标本中,有28例标本呈不同程度的TTF 1阳性表达,阳性率为75.67%。11例肺外腺癌胸腔积液中腺癌的细胞学特征与上述37例肺腺癌非常相似。11例标本TTF 1免疫组化染色均为阴性,阳性率为0%,与胸腔积液中肺转移腺癌细胞核TTF 1表达阳性率有显著差异(P 图3胸水中转移性肺腺癌细胞中TTF 1的表

    10、达,阳性细胞核(细胞蜡块切片SP法,非染色物镜放大40倍)表1不同组织中TTF 1的表达率胸水中转移性腺癌细胞蜡块切片注:*: P 2.2.2转移性肺腺癌和肺外腺癌细胞中TTF1表达的定量分析:我们用阳性单位来定量反映TTF1的表达,图像分析测试结果表明,癌性胸腔积液中转移性肺腺癌细胞核中TTF1的PU值明显高于乳腺癌、胃癌、卵巢癌、子宫内膜癌和结肠癌细胞核。 即胸腔积液中肺转移腺癌细胞核TTF 1的PU值明显高于非肺转移腺癌细胞核TTF 1的PU值(P 癌性胸腔积液中肺源性性腺癌细胞的最小PU值为9.05,而非肺源性性腺癌细胞的最大PU值为5.16,并且它们之间的频率分布没有重叠(图4) 因

    11、此,取PU值6和8作为两者之间的判别阈值是可行的。 表2胸腔积液中转移性性腺癌细胞TTF-1表达的定量分析 图4胸腔积液转移性性腺癌细胞TTF-1 PU值频数分布细胞蜡标本图2.3胸腔积液转移性性腺癌细胞TTF 1表达的诊断试验评价8 10表3为胸腔积液转移性性腺癌细胞TTF 1蛋白检测鉴别肺腺癌细胞的诊断试验评价数据及评价结果。 以TTF-1表达阳性和阴性结果为标准,癌性胸腔积液中肺腺癌细胞的敏感性(Se)、特异性(Sp)、标准化阳性预测值(SPPV)、标准化阴性预测值(SNPV)、标准化准确性(SAc)和标准化误诊率分别为75.67%、100%、100%、80.43%、87.84% 基于T

    12、TF 1表示的PU值,将PU值6和8用作判别阈值。当PU值大于8时,胸腔积液中的腺癌细胞诊断为肺源性;当PU值小于6时,胸腔积液中的腺癌细胞诊断为非肺源性。诊断试验的评价结果与基于阳性和阴性TTF 1表达的诊断试验的评价结果相同(见表3) 表3 TTF 1蛋白检测作为癌性胸腔积液中肺腺癌细胞标志物的诊断试验评价结果细胞石蜡切片3讨论转移性腺癌是恶性胸腔积液中最常见的上皮性恶性肿瘤,其常见的原发部位包括肺、乳腺、胃肠道和泌尿生殖系统,其中以肺组织最常见。 由于腺癌可发生于全身多个组织器官,仅通过病理形态学很难判断胸腔积液中腺癌细胞的来源,而仅通过细胞学涂片更难判断来源。 如果能使用强组织特异性抗

    13、体的免疫组织化学染色,将有助于分析和判断胸腔积液中转移癌的原发部位。 甲状腺球蛋白(TG)、前列腺特异性抗原(PSA)和肺表面活性蛋白(SPA,SPB)是较早使用的器官特异性抗体,而TTF-1是近年才发现的甲状腺和肺特异性基因的高效转录激活剂。据文献报道,其特异性和敏感性高于表面活性蛋白(SPA,SPB) 11 人TTF1由单个基因位点编码,全长约3.3 kb,包括两个外显子和一个内含子,与小鼠TTF1多肽有98%的同源性。 在甲状腺中,TTF-1能激活基因启动子的转录活性,如甲状腺球蛋白(TG)、甲状腺过氧化物酶(TPO)、Na/I转录蛋白和促甲状腺激素受体(TSHR)。 在肺组织中,它能激

    14、活表面活性蛋白A、B、C、D和Clara细胞分泌蛋白的转录活性,这些蛋白在肺的形态发育中起重要作用12 14 在正常肺组织中,TTF-1在成熟的肺泡型上皮细胞和肺气道支气管上皮细胞亚段中表达,而型肺泡上皮细胞从不表达15,16 对TTF 1在肺癌中的组织学研究表明,TTF 1在不同类型的肺癌中表达不同。 TTF 1在肺腺癌、肺小细胞癌和非典型类癌中的表达率较高,而在肺鳞癌、肺大细胞癌和典型类癌中不表达或低表达17 目前,TTF 1被认为是肺腺癌的标志18 20,由于TTF 1在间皮细胞中不表达,因此有利于区分肺腺癌与间皮瘤或间皮细胞增殖21 TTF-1判断转移性腺癌伴浆膜腔积液原发部位的研究表

    15、明,其诊断肺腺癌的敏感性为54%88.2%,特异性为98%100%1,2224 这些结果来自对胸腔积液制备的细胞蜡块和TTF-1染色的定性分析。 根据胸腔积液细胞石蜡切片定量检测TTF-1染色强度对胸腔积液中转移性腺癌原发部位的诊断分析价值尚未见报道。 因此,我们讨论了胸腔积液腺癌细胞石蜡切片中TTF-1的表达。 本研究选取经组织学、细胞学或临床资料证实的肺腺癌37例和肺外腺癌11例,比较观察TTF 1在肺腺癌和肺外腺癌中的表达。在此基础上,用图像分析系统检测癌细胞中TTF 1表达的阳性单位,定量反映TTF 1免疫组化染色反应的强度。结果表明,TTF 1诊断胸腔积液中癌性肺腺癌细胞的敏感性为7

    16、5.7%,特异性为0.5%。肺腺癌细胞核TTF 1的PU值是非肺腺癌细胞核TTF 1 PU值的3倍,两者差异显著(P 根据PU值的定量检测结果,作者认为6-8的PU值可作为判断胸腔积液中肺和非肺性腺癌细胞的诊断阈值。 当pu值大于8时,胸腔积液中的腺癌细胞为肺性,而当PU值小于6时,胸腔积液中的腺癌细胞为非肺性。 虽然TTF-1在甲状腺癌中也高度表达25,但甲状腺癌很少出现在胸腔积液中。 因此,胸水肺腺癌细胞TTF-1蛋白表达具有高度特异性和敏感性的特点,可作为胸水转移性肺腺癌细胞诊断和鉴别诊断的特异性指标,对明确诊断和临床治疗研究具有重要意义。 当怀疑胸腔积液中的癌细胞可能来源于甲状腺癌转移

    17、时,需要结合其他甲状腺特异性标志物进行鉴别,如甲状腺球蛋白。 参考文献 1 Gomez Fernandez C,Jorda M,Delgado P I,等.甲状腺转录因子1:体腔液中肺腺癌的标志物J.癌症,2002,96(5):289-293。2刘世凯,卢士林,艾森.甲状腺转录因子-1的研究进展J.应用免疫组织化学分子形态学,2002,10(2):97-102。3法布罗D,迪洛雷托C,斯塔梅拉O,等. TTF-1基因在人肺肿瘤中的表达J.欧洲癌症杂志,1996,32A:512-517。4Lazzaro D,Price M,de Felice M,等.转录因子TTF-1在甲状腺和肺形态发生开始时

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