临床医学论文-胶质瘤患者树突状细胞在裸鼠体内外诱导抗肿瘤免疫.doc

1、 临床论文胶质瘤患者树突状细胞在裸鼠体内外诱导抗肿瘤免疫【摘要】探讨胶质瘤患者树突状细胞(DC)能否在裸鼠体内外诱导抗肿瘤免疫。 方法用细胞因子诱导胶质瘤患者外周血树突状细胞，MTT法检测树突状细胞激活的细胞毒性T细胞对体外肿瘤细胞的作用。 裸鼠接种树突状细胞，一周后用神经胶质瘤细胞攻击。观察潜伏期、肿瘤率、肿瘤重量和肿瘤体积。 结果细胞因子可诱导患者外周血产生大量树突状细胞，树突状细胞激活的CTLs对胶质瘤细胞具有高效、特异的抑制和杀伤作用。 在裸鼠体内，DCs具有免疫保护作用，其成瘤率降低，潜伏期延长，肿瘤重量和肿瘤体积明显减小。 结论胶质瘤患者树突状细胞可在体内外诱导高效的抗肿瘤免疫。

2、【关键词】胶质瘤树突状细胞【摘要】目的进一步研究从胶质瘤患者体内获得的树突状细胞(DCS)能否在体内和裸鼠体内诱导抗肿瘤反应。方法用患者外周血细胞因子诱导树突状细胞。体内观察了树突状细胞刺激的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的抗肿瘤作用。然后在裸鼠被神经胶质瘤细胞攻击前一周给它们注射树突状细胞。结果患者外周血可诱导出树突状细胞，树突状细胞激活的CTLs可在体内诱导有效的抗肿瘤反应。此外，树突状细胞对裸鼠有保护作用，肿瘤重量或体积明显减小。结论从胶质瘤患者中获得的树突状细胞可诱导体内和裸鼠体内有效的抗肿瘤免疫反应。【关键词】胶质瘤；树突状细胞；脑胶质瘤是常见的颅内肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上

3、升趋势。 最近的研究表明，树突状细胞(DC)在启动、调节和维持肿瘤免疫反应中起着重要作用1 3 本实验通过观察树突状细胞在胶质瘤患者体内外的抗肿瘤作用，旨在探索胶质瘤免疫治疗的新途径。 材料和方法1.1材料细胞因子(IL-4、GM-CSF)购自Glaco公司；CD86、CD1a、HLA-DR、CD54、CD83McAb购自DAKO公司。外周血来自辽宁省锦州市中心医院临床确诊患者；胶质瘤细胞系SK-MG-1购自北京医科大学。SGC-7901人胃癌细胞系和BeL-7402人肝癌细胞系购自中山大学。 四周大的BALB/C裸鼠购自北京医科大学。 1.2方法1.2.1冻融抗原的制备取107个SK-MG-

4、1胶质瘤细胞，加入1ml生理盐水，反复冻融3次，稀释至10ml，微孔滤膜过滤，4保存备用。 1.2.2准备T细胞和树突状细胞，采集患者外周血。Ficoll不连续密度梯度离心法分离单核细胞。孵育2小时后，收集非贴壁细胞作为T细胞备用。贴壁单核细胞在含有GM-CSF(1000u/ml)、IL-4(1000u/ml)和15%FCS的完全培养基中培养。 三天后，将细胞分为两组:加载组(添加冻融抗原)和卸载组(添加培养基)。 在7天内收集悬浮细胞是DCs。 用CD86、CD1a、HLA-DR、CD54和CD83McAb标记，流式细胞仪检测树突状细胞表面分子。 1.2.3树突状细胞激活T细胞。将t细胞制成

5、1106细胞/ml悬液，加入24孔培养板(1ml/孔)。 用丝裂霉素处理DCs，并以120的比例加入到培养系统中。 72小时后收集的细胞是细胞毒性T细胞(CTL)。 1 . 2 . 4 CTLs的杀伤活性试验:将SK-MG-1、BeL-7402和SGC-7901细胞作为靶细胞(5000细胞/孔)加入96孔板中，将加载组中由DCs激活的CTLs、未加载组中由DCs激活的CTLs和未被DCs激活的简单T细胞加入培养基中作为阴性对照。 37，5% CO2 72小时，加入MTT小时，检测OD值。 1.2.5裸鼠体内实验将18只裸鼠随机分为3组，接种抗原DCS (2105细胞/只)和不接种抗原DCs(2

6、105细胞/只)，生理盐水作为对照组。 SK-MG-1胶质瘤细胞(2106细胞/小鼠)隔天注射一次，共注射3次，一周后注射。 观察成瘤率和潜伏期。 接种癌细胞后30天测量肿瘤重量和肿瘤体积(V=肿瘤最大直径和最小直径的2/2)。 1.2.6统计学方法所有数据均以xs表示，经单因素方差分析，差异显著。 结果2.2.1从胶质瘤患者外周血中可以获得大量含有细胞因子的树突状细胞。 流式细胞仪分析显示，有抗原和无抗原的DC表达CD86、CD1a、HLA-DR、CD54、CD83等表面分子。 2.2树突状细胞对T细胞杀伤靶细胞的影响加载组树突状细胞诱导的CTLs能特异性抑制和杀伤SK-MG-1胶质瘤细胞，

7、与其他组相比差异显著(P 0.01)，结果见表1。 表1树突状细胞对T细胞杀伤靶细胞的作用注:采用单因素方差分析，* p 0.01 2.3裸鼠、实验对照组小鼠和无抗原的树突状细胞组小鼠在肿瘤细胞攻击后一周均出现肿瘤(71天)，成瘤率为100%；负载抗原的DCs组的6只小鼠中有5只在第二周(142天)成瘤，成瘤率为84%。 肿瘤体积和重量见表2。 表2裸鼠实验肿瘤的重量和体积注:采用单因素方差分析，* p 0.01，*P 因此，如何扩大和增强肿瘤患者的树突状细胞免疫功能是肿瘤免疫治疗的关键4 研究表明，应用细胞因子可以促进人外周血中树突状细胞的优势增殖，增强其免疫功能。 因此，本实验采用细胞因子

8、从胶质瘤患者外周血单个核细胞中诱导扩增树突状细胞。结果负载抗原后，树突状细胞能在体外有效地将抗原提呈T淋巴细胞，并使其形成具有杀伤活性的CTL，从而对SK-MG-1胶质瘤细胞产生高效、特异的杀伤和抑制作用。 此外，在裸鼠体内实验中，作者发现接种了负载抗原的树突状细胞的裸鼠能够抵抗癌细胞的攻击，潜伏期长，成瘤率低，肿瘤体积和重量比其他组小，表明负载抗原的树突状细胞能够有效地诱导抑制和杀伤裸鼠体内的SK-MG-1胶质瘤细胞，使机体能够有效地保护和抑制肿瘤细胞的攻击和肿瘤的生长。 用全细胞抗原加载DCs是一种简单有效的方法，不需要鉴定抗原，多种肿瘤抗原的存在可以降低抗原阴性逃逸突变的风险5，6 因此

9、，作者采用肿瘤细胞冻融抗原直接作为肿瘤抗原负载DCs，由DCs选择肿瘤抗原，加工并呈递，有效激活T细胞，从而诱导肿瘤特异性免疫反应。 该方法简单、有效，便于临床应用。 本实验采用细胞因子从胶质瘤患者外周血中诱导扩增大量树突状细胞。负载肿瘤抗原后，可在体内外抑制裸鼠胶质瘤细胞生长，增强机体抗肿瘤能力，既解决了胶质瘤患者树突状细胞数量极少的问题，又增强了树突状细胞的免疫功能。 如果将这些树突状细胞回输到患者体内，无疑将为恢复和增强癌症患者的抗肿瘤免疫力提供有效途径。 参考文献 1迪里格洛，克鲁斯JM，路易斯雷脐血CD14+和CD34+来源的致密细胞的共刺激作用。实验病理学，2003，75(1):18-33.2苏敏，钟翠萍。树突状细胞摄取和加工外源性抗原的机制。解剖科学进展，2003，9 (3):242-245.3，陈，等.树突状细胞和外泌体体外抗胶质瘤细胞活性的研究.免疫学杂志，2006。李东田。树突状细胞与肿瘤免疫治疗。天津医学，2000，28(9):574-576.5顾涛，朱，等.肿瘤细胞冻融上清液对凋亡细胞负载树突状细胞生物学特性的影响.中国病理生理学杂志，2003，19 (3): 301-305。使用肿瘤裂解物脉冲的树突状细胞刺激自体抗肿瘤T细胞对甲状腺髓样癌的反应。临床内分泌代谢杂志，2002，87(3):1098-1104。