临床医学论文-胰蛋白酶在胰腺癌疼痛中的作用.doc

1、 临床论文胰蛋白酶在胰腺癌疼痛中的作用作者:鲁治杰、吴飞翔、苗学荣、于伟峰【摘要】目的观察胰腺癌疼痛患者胰腺肿瘤标本中胰蛋白酶mRNA及其蛋白的表达。 方法取视觉模拟疼痛评分(VAS)在5分以上的胰腺肿瘤患者新鲜组织标本，用RT-PCR和ELISA方法检测胰蛋白酶mRNA及其蛋白的表达。 结果胰腺癌组织中人胰蛋白酶mRNA水平明显高于正常胰腺组织。ELISA显示胰腺癌组织中胰蛋白酶水平明显高于正常胰腺组织，差异有统计学意义(P 结论高水平胰蛋白酶可能通过激活PAR-2介导胰腺癌痛。 【关键词】胰蛋白酶；胰腺肿瘤；痛苦；激活受体-2摘要:目的研究胰腺癌疼痛患者胰腺肿瘤标本中胰蛋白酶的表达。方法采

2、用rt-PCR和ELISA方法检测胰腺癌疼痛VAS评分5分患者新鲜组织标本中胰蛋白酶mRNA及其表达。结果胰腺癌组织中mRNA水平明显高于正常胰腺组织。ELISA结果显示胰腺癌组织中胰蛋白酶水平明显高于正常胰腺组织(P 胰腺癌患者疼痛是很常见的，胰腺癌患者疼痛的发生率和严重程度与肿瘤的程度有关。约30%60%的早期胰腺癌患者和80%以上的晚期胰腺癌患者有癌痛经历，死亡前癌痛发生率高达90%。 胰蛋白酶是蛋白酶的一种，作为胰蛋白酶的前体在胰腺中合成，是一种内肽酶，能切断多肽链中赖氨酸和精氨酸残基的羧基侧。 它不仅起消化酶的作用，还能限制糜蛋白酶、羧肽酶、磷脂酶等酶前体的分解，发挥积极作用。 胰蛋

3、白酶还可以激活蛋白酶激活受体-2 (PAR-2)。近年来发现蛋白酶激活受体-2可能介导胰腺炎的疼痛2。将胰蛋白酶和PAR-2特异性肽激动剂注射到清醒大鼠的胰管中可引起疼痛的行为反应。 胰腺组织中的胰蛋白酶在胰腺炎症发生时可以激活PAR-2，但在胰腺癌发生时是否也有蛋白酶的高表达？因此，我们选取东方肝胆外科医院确诊的视觉模拟疼痛评分(VAS)在5分以上的胰腺癌患者的新鲜组织标本，检测胰蛋白酶mRNA及其蛋白的表达，以验证胰蛋白酶是否高表达并激活PAR-2引起胰腺癌疼痛。 材料与方法1.1实验材料选取人胰腺癌患者的新鲜肿瘤组织。 人胰蛋白酶ELISA试剂盒是武汉中美科技有限公司的产品。 科斯亮蓝试

4、剂盒是南京程健生物工程研究所的产品。 RT-PCR试剂盒是德国Qiagen公司的产品。 Tag酶是美国BioLabs公司的产品。 1.2标本选择与分组分为两组，实验组10例为胰腺癌组，视觉模拟疼痛评分(VAS)在5分以上；对照组10例为正常胰腺组织组。 1.3 rt-PCR检测人胰蛋白酶mRNA的表达。人胰蛋白酶基因序列(NM-002771.2)从基因库获得。根据其序列特点，设计的引物序列如下:5-catgttctgtgggcttctt-3；5-GTAGACCTTGGTGTAGACTCC-3 将预样品匀浆，加入1ml Trizol试剂，摇匀15 s，然后加入200 l苯酚，混匀，加入200 l

5、氯仿:异戊醇溶液，混匀。 在4和15 000 r/min下离心10 min，将上清液提取到新试管中；加入400 l氯仿:异戊醇溶液，混匀，在4和15 000 r/min下离心10 min，将上清液泵入新管，用500 ml异丙醇在室温下沉淀10 min，在4和15 000 r/min下离心10 min，弃去上清液，用1 ml 70%乙醇溶液洗涤两次，溶于50 l Milliq水中，用分光光度计检测。 然后用上述引物进行RT-PCR，解链温度54，30个循环。 1.4 ELISA检测人胰蛋白酶水平的变化。取正常胰腺组织和胰腺癌组织，匀浆后用考马斯亮蓝测定总蛋白，用双抗体夹心ABC-ELISA法检测

6、，将抗人胰蛋白酶单克隆抗体包被在酶标板上，将标准品和样品中的人胰蛋白酶与单克隆抗体结合，加入生物素化的抗大鼠人胰蛋白酶，形成免疫复合物连接到板上。辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素与生物素结合，当加入酶底物OPD时变黄，加入终止子硫酸时颜色变深。在450 nm处测量OD值时，人胰蛋白酶的浓度与OD值成正比，绘制标准曲线即可计算出样品中人胰蛋白酶的浓度。 1.5统计学方法计量数据以均数标准差表示，用SAS 6.12统计软件分析，数据比较采用近似f检验(SNK-q)，P 结果2.2.1手术标本的选择成功获得10例人胰腺癌组织标本，其中7例病理为胰头癌，3例为胰体尾腺癌。 所有患者的视觉模拟评分(vas

7、)均 5分。 此外，获得对照组中的10个正常胰腺组织标本。 2.2 RT-PCR检测人胰蛋白酶mRNA的表达。通过rt-PCR确定人胰蛋白酶mRNA的水平，并扩增134 bp的序列，如图1所示。 胰腺癌组织中人胰蛋白酶mRNA水平明显高于正常胰腺组织。 图1 RT-PCR显示胰腺和胰腺癌组织中胰蛋白酶mRNA的水平2.3 ELISA检测人胰蛋白酶水平的变化。ELISA的标准曲线方程为y=176.55x -0.623 6，相关系数R2=0.998 1，具有良好的相关性。 标准曲线如图2所示。 根据测得的OD值和标准曲线计算胰腺癌和正常胰腺的胰蛋白酶值，胰腺癌的胰蛋白酶水平明显高于正常胰腺(P 详

8、见表1(因胰腺癌组有3例胰腺组织坏死，无法检出，故检出7例。 为便于比较，还测量了正常组的7例) 表1胰腺癌与正常胰腺组织胰蛋白酶水平比较3胰腺癌腹痛的讨论胰腺癌腹痛有多种表现，在胰腺癌的病程、诊断和治疗过程中均可发生变化。 腹痛的典型表现是上腹痛。腹痛的性质是常见的上腹部钝痛、阵发性剧烈上腹痛和累及腰背部的上腹痛。 本研究选择的方法多以腹痛为首发症状3，视觉模拟疼痛评分(VAS)在5分以上。 胰腺癌晚期的疼痛相当剧烈，不仅表现为身体上的疼痛，还表现为全方位的社会、心理和精神上的疼痛，常伴有强烈的自主神经系统和心理异常，部分患者对癌痛的恐惧甚至超过了对死亡的恐惧。 因此，癌痛控制已成为患者的第

9、一需求，也是胰腺癌姑息治疗不可或缺的一部分。 胰蛋白酶是蛋白酶的一种，半数以上的胰腺癌患者胰蛋白酶升高。 肿瘤侵犯正常胰腺会导致胰蛋白酶被激活。 此外，其他能激活PAR-2的蛋白酶可能在肿瘤组织中分泌。 因此，肿瘤组织完全有可能通过这些蛋白酶直接激活初级传入神经元，进而将伤害性信号逐级传递到中枢，这很可能是胰腺癌疼痛发生和维持的重要机制之一。 本研究采用ELISA和RT-PCR方法检测胰腺癌组织中胰蛋白酶及其mRNA的水平，发现胰腺癌组织中胰蛋白酶及其mRNA的水平显著高于正常胰腺组织(P 同时还促进胰蛋白酶和蛋白水解酶与PAR-2结合，激活PAR-2，通过细胞内信号转导传递疼痛信号，导致胰腺

10、癌疼痛的发生。 这与Kayssi等人4对结肠的研究是一致的。认为胰蛋白酶和PAR-2通过自分泌和正反馈促进肿瘤增殖，同时激活MAPK-ERK通路，同时抑制IK电流，从而使DRG神经元处于高兴奋状态，维持长期内脏痛。 胰蛋白酶是最有效的PAR-2激活剂5，可以激活胰腺导管上皮细胞的PAR-2。 活化的PAR-2可通过磷酸肌醇、酪氨酸磷酸化、蛋白激酶C、Ca2+等介导细胞内信号转导。近年来，研究主要集中在细胞外信号调节激酶(ERK)转导通路6 7 PAR-2激活剂可以多种方式激活ERK1/2。ERK1/2激活后，可磷酸化细胞骨架蛋白、微管相关蛋白和磷脂酶A2，启动多种胞质反应。ERK还可以激活cA

11、MP反应元件结合蛋白(CREB)以CREB依赖的方式调节下游基因的表达，包括c-fos、NK-1、强啡肽和BDNF等。 在CCI神经病理性疼痛的大鼠模型中，鞘内注射ERK抑制剂U0126或ERK反义寡核苷酸可以减弱机械性超敏反应和痛觉过敏，这表明ERK信号通路与CCI诱导的神经病理性疼痛有关9 因此，蛋白水解酶-PAR-2-ERK-CERB信号转导通路可能是胰腺癌引起长期疼痛的可能机制。 总之，本研究通过测量胰腺癌疼痛患者的胰蛋白酶水平，发现胰腺癌组织中胰蛋白酶及其mRNA水平的升高可以激活PAR-2，PAR-2可能通过PKC、ERK等途径介导疼痛的发生。 1王力，杨功焕，李惠，等. 1991

12、-2000年中国胰腺癌死亡率的变化J.中华内科杂志，2005，44: 509-513。2 Hooger Werfwa，Shenoy M，Winston JH，等.胰蛋白酶通过蛋白酶激活受体2介导伤害性感受:在胰腺疼痛中的潜在新作用J.胃肠病学，2004年，27: 883-891。3王成峰，赵。胰腺癌的预防和早期诊断J.国际外科杂志，2007，34 (9): 584-587。4 Kayssia，Amadesis，Bautista F，等.蛋白酶激活受体2诱发小鼠结肠痛觉神经元过度兴奋的机制J.生理学，2007年，80: 977-991。5窦，等.蛋白酶激活受体的研究进展J.世界华人消化杂志，20

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