1、 临床论文-组织相容性胶原-透明质酸钠复合膜作为组织工程心脏瓣膜支架作者:刘星光余世强张启清魏向阳辉【关键词】组织工程心脏瓣膜【摘要】目的筛选一种组织相容性好、降解时间适宜、无毒性和/或炎症反应的新型组织工程心脏瓣膜支架材料。 方法用扫描电镜观察材料的微观结构。在无菌技术下将胶原-透明质酸钠复合膜植入兔皮下，分别于2、4、6、8、12、14周取出。通过大体观察和he观察膜的降解程度和组织反应。从犬大隐静脉分离培养内皮细胞和间质细胞，用免疫组织化学方法进行鉴定。选择增殖活跃的细胞种植于膜上，培养7天，分3次，倒置显微镜和he切片光镜观察。 结果胶原-透明质酸钠复合膜呈蜂窝状，孔径为(1129)
2、m 兔皮下包埋实验表明，该材料具有良好的组织相容性，完全降解时间为12 14周。 细胞种植实验表明，两种细胞均覆盖在材料表面，间质细胞长入材料的孔隙中。 结论大隐静脉内皮细胞和间质细胞是理想的种子细胞。胶原-透明质酸钠复合膜具有良好的组织/细胞相容性、适宜的降解时间和孔结构，初步认为是一种可用于组织工程心脏瓣膜支架的生物材料。 关键词胶原-透明质酸钠复合膜组织/细胞相容性摘要目的筛选一种组织/细胞相容性好、降解时间适宜、无毒性降解和/或炎症反应的有前途的心脏瓣膜组织工程基质材料。方法扫描电镜观察显微结构；将C-SHA复合膜在无菌条件下植入兔皮下，分别于2、4、6、8、12、14周取出，通过大体
3、和HE观察其生物降解性和组织相容性；从移植的犬大隐静脉中分离培养内皮细胞和间质细胞，用免疫组织化学方法鉴定，然后将活化的细胞分别在7天内共接种C-SHA膜3次，倒置显微镜和HE观察。结果C-SHA膜呈蜂窝状海绵，孔隙率大于90%，孔径为(1129)微米，具有良好的组织相容性和12 14周的降解时间。倒置显微镜和HE显示2种细胞覆盖在C-SHA膜上，ICs长入孔中。结论本研究初步证明了犬隐静脉内皮细胞和间充质细胞在临床上可作为一种替代细胞来源获得；C-SHA膜具有良好的组织/细胞相容性、适宜的降解时间和微观结构，是一种合适的生物可降解的心脏瓣膜组织工程基质支架。关键词心脏瓣膜基质材料组织工程胶原
4、-铝酸钠复合膜组织/细胞相容性心脏瓣膜置换术是心脏外科治疗严重瓣膜疾病的既定方法。有三种常用的瓣膜替代物:机械瓣膜、生物瓣膜和同种瓣膜。 这些阀门功能良好，但也有其固有的缺点。 组织工程心脏瓣膜，始于20世纪90年代中期，利用组织工程的原理和技术，在可降解支架材料上种植自体细胞，培养自体心脏瓣膜，具有良好的组织相容性、无免疫原性、良好的耐久性、无需终身抗凝、具有生物活性，可为生长期儿童提供潜在的生长能力，修复积累的伤口1 在组织工程研究中，寻找一种能够充分发挥组织再生潜能的仿生细胞外基质-支架材料是重要内容和难点之一。 支架材料主要起到瓣膜的机械构型和细胞粘附载体的作用。种子细胞种植在支架上粘
5、附、增殖并分泌细胞外基质(ECMs)用于组织塑形，而支架逐渐降解。 它不仅影响细胞的生物学行为和培养效率，还决定了移植后能否与机体很好地适应、结合、修复和替代，是限制组织工程能否真正应用于临床的关键因素。 对胶原-透明质酸钠复合膜的微观结构、组织相容性和降解时间进行了研究，并对其在组织工程心脏瓣膜中的应用进行了评价和展望。 材料与方法1.1材料胶原蛋白-透明质酸钠复合膜由中国医学科学院生物工程研究所张启清教授提出。 1.2方法1.2.1材料显微结构观察材料用2.5%戊二醛固定，乙腈梯度脱水，然后用扫描电镜(日本日立S-520)观察。 同时将材料石蜡包埋，普通光镜下he染色。 1.2.2材料的皮
6、下包埋-组织相容性实验参照王刚、张启清等的方法。2，材料准备尺寸为1.0cm1.0cm，60 Co12000Gy辐照消毒。 新西兰白兔肌肉注射846合剂0.2ml/kg麻醉，俯卧位固定在手术台上。 准备背部两侧皮肤，用软肥皂水擦洗，无菌生理盐水冲洗，碘伏消毒，铺毛巾。 在兔背侧胸腰段脊柱两侧做三个切口，被动分离皮下组织，形成皮下腔。 每只兔子对称植入2块6块材料，横向间距4cm，纵向间距4cm。 缝合和喂养后无压力包扎。 分别于术后2、4、6、8、12、14周取出，在普通光学显微镜下观察。 1.2.3犬隐静脉内皮细胞的培养和鉴定。成年杂种犬肌肉注射846合剂0.2 ml/kg体重麻醉，无菌操作
7、下取10 15 cm隐静脉，放入预冷的PBS溶液中。 剥离外膜的结缔组织，结扎分支，然后放入培养皿中，用PBS洗涤3次。 从静脉一端插入静脉留置针，结扎固定，再用丝线结扎另一端。 通过静脉留置针向血管内注入1000U/L胶原酶，直至血管充盈。 在37培养箱中消化15分钟，收集消化液，然后用10毫升DMEM溶液冲洗管腔。 将消化液和洗涤液离心10分钟(1000转/分钟) 吸取上清液，用DMEM培养液悬浮沉淀的细胞 将细胞接种于50毫升培养瓶中，加入5毫升含20%新生小牛血清的DMEM溶液，于375% CO2培养箱中培养 每2 3天换一次液。 细胞汇合后，进行传代培养。 鉴定了因子VIII抗体。
8、1.2.4犬大隐静脉间质细胞的培养和鉴定材料来源于消化内皮细胞后的同一条犬大隐静脉。 采用种植块培养的方法。 新鲜PBS溶液在血管腔内外冲洗3次；放在干燥的培养皿中，滴一点DMEM培养液保持组织湿润，用眼用剪刀将血管绞成糊状；向培养皿中加入5ml无血清DMEM培养液，反复吹气；在离心管中以1500转/分钟离心5min，弃去上清液；接种于25ml培养瓶中，间距0.5cm，20 30片，加入少量含20%新生小牛血清的DMEM溶液(24小时后，加至5ml的全量)，置于375% CO2培养箱中培养；每2 3天换一次液。 当细胞生长形成单层时，进行传代培养和a-SMA鉴定。 1.2.5细胞种植:将材料制
9、成6块，每块1.0cm1.0cm，共12块，分两组置于48孔培养板中，一组为内皮细胞，另一组为间质细胞。 60 Co12000Gy辐照消毒后，在DMEM 37、5%CO 2培养箱中浸泡48h，新生小牛血清浸泡12h。 生长状态良好的3 5代内皮细胞用0.25%胰蛋白酶消化成细胞悬液，以2105/孔接种于支架材料上，加入含20%新生小牛血清的DMEM液，37下于5%CO 2培养箱中培养 在第3天和第5天之间间隔48小时，用相同数量的细胞接种两次。 倒置显微镜下每天观察细胞生长状态1 2次。 第8天，取出材料，用he切片光镜观察。 间质移植和内皮细胞 结果2.1材料微观结构胶原蛋白-透明质酸钠复合
10、膜外观呈乳白色，质地柔软，有一定的韧性和拉伸性。 HE染色呈均匀的红色染色，纤维网状结构疏松。 扫描电镜显示C-SHA复合膜的孔形状为圆形或椭圆形，相互连通时呈蜂窝状海绵状。孔隙率大于90%，孔径为(1129) m 2.2材料的组织相容性(1)大体观察:2周组材料体外可触及，轮廓清晰，纤维包膜薄，疏松，易与材料分离。 4周组，材料在体外仍可触及，纤维囊略有增厚。剥离后，可见纤维结缔组织与材料结合紧密但仍易分离。 第6周和第8周，纤维包膜变薄，与材料结合紧密。材料仍以膜的形式存在，表面的孔隙明显扩大，表现出以孔洞形式降解吸收的现象。 12周组大部分材料被吸收，材料变得极薄，与纤维结缔组织融为一体
11、。 4周的小组材料已经完全吸收了。 各组均无血管增生、脓肿和坏死。 (2)组织细胞学观察:第2、4周组包膜纤维结缔组织疏松，有少量成纤维细胞增生，伴有较多中性粒细胞、淋巴细胞和浆细胞。 第6周和第8周，材料进一步被纤维结缔组织取代，以淋巴细胞浸润为特征。 第12周组，材料多为纤维结缔组织，炎症细胞几乎消失。 在14周组，材料完全吸收，代之以均匀的红色染色纤维结缔组织，没有发现炎症细胞。 各组均未发现组织变性或坏死。 2.3内皮细胞的培养和鉴定原代犬隐静脉内皮细胞(EC)在培养瓶中5 6小时后开始贴壁并伸展。细胞的初始状态大多是圆形的。拉伸后细胞呈短梭形，细胞核呈圆形或长圆形，有一至数个核仁，可
12、见许多有丝分裂像。 细胞在集落中生长，并且在更换液体48小时后生长加速。 第4天，细胞集落开始聚拢，细胞呈多边形。第5天，内皮细胞完全融合，呈鹅卵石状，细胞排列紧密，胞质丰富。 这时候就开始了继代培养。 因子相关抗原抗体染色倒置显微镜下呈强阳性表达，核周细胞质呈亮黄褐色。 2.4间充质细胞的培养和鉴定组织块植入培养瓶12小时后，长梭形细胞贴附在块周围的壁上。第三天，70%的细胞融合。取出块换液后，细胞增殖活跃，第5天完全汇合，呈长梭形，不规则形，细胞排列紧密，胞质丰富。 这时候就开始了继代培养。 A-SMA免疫组化染色显示大部分细胞呈阳性，核周细胞质呈亮黄褐色。 2.5细胞植入将内皮细胞和间质
13、细胞分别植入材料上，6 8小时后两者均贴壁。48小时后，发现贴壁细胞分布不均匀，不能完全覆盖材料表面。 第二次和第三次接种后，细胞完全覆盖材料表面，细胞形态分别与2.3和2.4所述相同，没有变化。 HE染色切片显示两种细胞均覆盖在材料表面，间质细胞长入材料的孔隙中。 讨论3.1支架材料的选择是组织工程的上游问题。目前主要使用三种支架材料，即脱细胞生物瓣膜(同种或异种)，如猪主动脉瓣或人肺动脉瓣。天然材料，如明胶、胶原蛋白、弹性蛋白、壳聚糖、纤维蛋白凝胶等。可降解高分子材料:如PLA、PGA、PLGA、PHB、PHO、PHA等。 然而，它们仍然有许多缺点3。出于这些原因，研究人员正在积极寻找其他
14、类型的支架材料。 目前，新型复合杂化支架材料是一个新的研究热点，它结合了两种或两种以上材料的优点，可以更好地满足不同组织工程的要求。 本实验正是基于这一期望制备了C-SHA复合膜。 透明质酸(HA)广泛存在于动物组织的间质中。市售HA一般为其钠盐，即透明质酸钠(SHA)，是一种广泛存在于人体结缔组织细胞外基质中的多糖物质，是由葡萄糖醛酸和乙酰葡萄糖交替组成的长链分子，是一种酸性粘多糖。 具有保湿性、润滑性、生物相容性、生物降解性、细胞粘附性等功能。目前已开发应用于新药缓释基质、抗凝血和抗血栓复合材料、软组织填充材料、抗瘢痕美容材料和组织工程支架材料。 最近Y. Dausse 4用SHA和藻酸盐
15、的共混物作为软骨组织工程支架，发现共混物具有良好的降解性和细胞亲和性。 胶原蛋白是一种由动物细胞合成的生物聚合物。它是人类和脊椎动物中含量最丰富、分布最广的蛋白质。它抗原性低，具有良好的生物相容性和可降解性，是最早使用的生物材料之一。 国内王刚、赵东赫等人的研究2认为以胶原膜为支架构建组织工程心脏瓣膜是可行的，但其组织/细胞相容性有待进一步提高。 3.2组织工程支架材料应具有良好的结构相容性5能保持稳定的三维结构。海绵状或纤维状网状三维支架具有相互连通的孔隙结构，孔隙率达90%以上，孔径大小适宜，能为种子细胞的均匀分布和生长提供足够的空间，也有利于营养物质和代谢产物的扩散。 胶原-透明质酸钠复
16、合膜的孔径为(1129)微米，孔隙率在90%以上。间充质细胞能很好地生长到材料中，说明其符合组织工程心脏瓣膜支架材料的要求。 3.3组织工程支架材料应具有良好的组织相容性和适中的生物降解速率5其本身或降解产物不会引起炎症和免疫排斥反应；降解速度要和组织再生速度相匹配，最后才能完全吸收或安全排泄。 皮下包埋实验显示，第12周组大部分材料被纤维结缔组织取代，炎症细胞几乎消失。 14周组，材料完全吸收，无炎性细胞浸润。 各组均未发现组织变性或坏死。 Sodian 6和Stock 7认为瓣膜支架的降解时间不应少于8周，长于52周。 胶原-透明质酸钠复合膜的吸收时间为12 14周，降解产物为CO 2和H
17、 2 O，认为符合组织工程心脏瓣膜支架材料的要求 3.4组织工程支架材料应具有良好的细胞相容性，即良好的有利于细胞黏附的材料-细胞界面5。生长和种植实验表明，两种细胞都覆盖在材料表面，间质细胞生长到材料的孔隙中。 原因可能是胶原蛋白和透明质酸钠是正常组织的细胞外基质，具有良好的组织相容性，其表面存在一些细胞结合位点和氨基酸序列，使其具有良好的细胞相容性。 大隐静脉内皮细胞和间质细胞容易获得，可以在体外大量扩增培养，是未来临床使用的理想种子细胞。胶原-透明质酸钠复合膜具有良好的组织/细胞相容性、适宜的降解时间和孔结构。初步认为它是一种可用于组织工程心脏瓣膜支架的生物材料。 参考1 Shinoka
18、 T，布鲁尔CK，Tanelke。组织工程心脏瓣膜叶置换的Alamb模型研究。安苏拉瑟尔，1995年，60(6):513-516页。2王刚，张启清，赵东赫，等。胶原膜和聚-羟基丁酯在组织工程心脏瓣膜中的应用研究。中国危重病急救医学，2001，13 (8): 342-345.3，黄，等. 6(18):2758-2759 .4 Y.Dausse L，Grossin G，Miralles S，等。使用新型多糖生物材料进行软骨修复:软骨缺损大鼠模型中的宏观、组织学和生物化学方法。骨关节炎与软骨，2003，11(11):16-28。5 Terada S，Sato M，Sevy A，等. 21世纪的组织工程.延世医学杂志，2000年，第14期:685-691页。6 Sodian R，Sperling JS，Martin DP，等.三叶心脏瓣膜的组织工程-组合聚合物的早期体外试验。组织工程，1999，5(5):489-494。7基于PGA/PLA共聚物的心脏瓣膜的组织工程。长期有效的植入物，2001，11(3-4):249-260。
鄂公网安备 42010502001450号
