临床医学论文-胰腺组织单细胞悬液制备方法的比较研究.doc

1、 临床论文-胰腺组织单细胞悬液制备方法的比较研究作者:张兆辉，李希，夏安洲路，隗洋，陈福兴【关键词】胰腺摘要:目的:寻找更好的胰腺组织单细胞悬液制备方法。 方法:以大鼠胰腺冷缺血组织为标本，分别采用剪切法和研磨法制备胰腺组织悬液。 台盼蓝染色法测定细胞存活率，流式细胞仪分析。 结果:剪切法细胞形态较为完整，存活率高。两种方法的APO和变异系数有显著性差异(P 结论:剪切法制备胰腺组织单细胞悬液优于研磨法。 关键词:单细胞悬液；胰腺；两种胰腺组织单细胞悬液制作方法的流式细胞术比较研究摘要:目的:探讨胰腺组织单细胞悬液制作的机械方法。方法:所有实验标本均取自冷缺血后大鼠胰腺。用流式细胞仪检测“切割

2、”和“匀浆”法得到的单细胞悬液。通过typan蓝排除法评估细胞活力；观察细胞形态学变化。结果:切割法获得的细胞完整，活力好，APO率和CV值低。结论:用sissors“切割”法制作肾组织单细胞悬液优于“匀浆器”法。关键词:单细胞悬液；胰腺；流式细胞术(FCM)是近年来发展起来的一种新的细胞分析技术，具有快速、准确、高灵敏度和多参数的特点1 在这项技术中，细胞的分析和检测都是以单个细胞为基础的，因此单细胞悬液样品的制备是关键环节。样品中细胞数量不足、细胞粘连、杂质碎片过多均可导致分析失败，固体组织中单细胞悬液的制备尤为困难。 本实验采用剪切法和研磨法制备新鲜胰腺实性组织单细胞悬液，旨在通过胰腺细

3、胞活力的测定和流式细胞仪分析比较两种方法的优缺点。 材料和方法1.1试剂和仪器:FACS Calibur流式细胞仪(美国B.D .公司)；XD-101倒置显微镜(江南制造厂)；台盼蓝和碘化丙锭(均为适马公司) 1.2实验标本:10只SD大鼠，雌雄不限，由徐州医学院实验中心提供，按照文献2的方法制备胰腺冷缺血模型。切取胰腺组织，检测各项指标。 1.3单细胞悬液的制备:无菌条件下，将胰腺置于平板中，用PBS去除胰腺组织表面的血液和血凝块，从同一大鼠胰腺中取两块大小约0.5 cm3的新鲜组织块，分别切取和研磨制备组织悬液。 1.3.1剪切法:将组织块放入平板后，加入少量PBS；用眼剪将组织切成匀浆，

4、加入10ml PBS用吸管吸取组织匀浆，用200目尼龙网过滤到试管中；将沉淀物离心1500 prm3 min，然后用PBS洗3次，每次以500 prm低速短时离心去除细胞碎片，用300目尼龙网过滤细胞团。 计数细胞并将细胞浓度调节至(2 5) 106个/ml。 常温放置，检测细胞活力。 1.3.2匀浆法:用眼剪将组织切成小块；放入70毫升组织研磨机中，加入2毫升PBS；慢慢转动研磨棒，研磨至均匀；用10毫升PBS冲洗研磨机；收集细胞悬液，用300目尼龙网过滤；离心沉淀800 prm2 min，然后用PBS洗涤3次，离心沉淀。 以下处理与剪切法相同。 1.4形态学观察和细胞活性测定:取制备好的胰

5、腺细胞悬液，在倒置显微镜下观察其形态学变化；取每组细胞悬液9滴，加入一滴台盼蓝溶液，混匀，然后在4冰箱中静置20分钟，在光学显微镜下用血小板计数板计数活细胞和死细胞。 1.5荧光染色:取细胞悬液，用70%预冷的乙醇固定过夜，然后用4 PBS洗两次。 加入0.5 ml PBS悬浮细胞，再加入50 g/ml碘化丙啶染色，4避光染色，过200目尼龙网，流式细胞仪检测。 用CellQuest软件自动获取10，000个细胞/样品，用ModFit LT软件分析DNA含量。 主要检测指标:凋亡水平(APO)、G0/G1细胞比率、DNA指数(DI)、S期细胞比率(SPF)、CV值。 1.6统计处理:所有数据均

6、以均数标准差表示，差异显著性分析采用配对t检验。 2出菇2.1细胞形态:倒置显微镜下观察，剪切法获得的胰腺细胞形态完整，分散性好，背景干净，杂质少，而研磨法视野内细胞碎片较多，完整细胞相对较少。 台盼蓝排斥试验检测两种分离方法获得的细胞存活率，剪切法平均为78%，研磨法平均为52%。 2.2 FCM检测结果:从DNA直方图可以看出，匀化法的图形比剪切法差，表现为G1峰明显增宽，在G1峰之前出现一个宽的碎片峰。 DNA含量参数比较(表1):两种方法的G0/G1细胞比率、DI和SPF无显著性差异(P 0.05)，但匀浆法的凋亡水平和CV值显著高于剪切法(P 表1不同制备方法对细胞APO、DI、G0

7、/G1、S、CV值的影响(略)3讨论流式细胞术是近年来发展起来的一种新的细胞分析技术，广泛应用于细胞凋亡等方面的研究，具有快速、准确、高灵敏度、多参数等特点。 然而，单细胞悬液的制备是流式细胞仪分析的关键环节，尤其是在固体组织分散细胞悬液的制备中，仍有许多问题需要解决，至今没有合适的通用方法。 采用哪种方法可以获得产量高、活性高、功能强的单细胞，非常有必要进行进一步的实验研究。 因此，可以根据具体的实验目的和不同的组织特性，选择合适有效的单细胞悬液制备方法。 目前，固体组织细胞悬液的制备方法主要有两种:机械法和酶消化法。由于胰腺组织中纤维组织较多，实验前期采用了添加纤溶酶和胰蛋白酶的酶消化法，

8、但未获得足够细胞浓度( 1106)的单细胞悬液，可能与胰腺腺泡细胞中存在大量消化酶有关。 机械方法主要是给组织更大的压力，使细胞从组织中释放出来。 本实验比较了两种制备胰腺细胞悬液的方法。显微镜下，剪切法的细胞形态比较完整，背景干净，杂质少，细胞存活率高。匀浆法制备的细胞悬液DNA直方图质量差，主峰宽，主峰前有许多混沌信号。根据DNA参数分析，剪切法的凋亡水平和CV值明显低于研磨法，但DI、SPF和G0/G1细胞比率无明显差异。 与剪切法相比，机械法中的研磨法更容易在研磨过程中损伤更多的细胞，容易导致胰腺细胞死亡，完整细胞相对较少，细胞存活率较低。 研磨过程中损伤的细胞和细胞碎片经PI染色后可

9、出现低荧光，显示在凋亡峰位置，出现部分假阳性，导致APO检出率较高。 CV值包括两部分。一个是标准测得的仪器CV值和实验样品测得的CV值之和。CV值越小，曲线分布越窄、越集中，测量误差越小。 实验表明，两种方法的CV值有明显差异，剪切法样品的CV值明显低于研磨法。 基于以上分析，我们认为酶消化耗时长，难以获得足够浓度的单细胞悬液。在机械法中，剪切法不仅比研磨法简单，而且细胞存活率更高，检测精度更好。 因此，剪切法制备胰腺组织细胞悬液优于研磨法。 参考文献:1马文鑫。流式细胞术技术与原理J.世界医疗器械，1998，4 (4): 28。2张兆辉，李希，陆葵阳，等.大鼠胰十二指肠移植模型的建立J.徐州医学院学报，2003，23 (3): 2000