临床医学论文-胰岛素样生长因子1和肿瘤坏死因子α对C2C12骨骼成肌细胞增殖和分化的影响.doc

1、临床医学论文-胰岛素样生长因子1和肿瘤坏死因子对C2C12骨骼成肌细胞增殖和分化的影响【摘要】 目的观察胰岛素样生长因子I(IGFI)和肿瘤坏死因子(TNF)对体外培养的C2C12小鼠骨骼成肌细胞增殖、分化的影响。方法体外培养C2C12小鼠骨骼成肌细胞,分别采用IGFI、TNF和 IGFI+TNF干预细胞,以 MTT法、肌酸激酶(CK)活性测定法检测处理后的细胞在增殖、分化方面的变化。结果IGFI组24,48和72 h增殖程度均高于对照组(P0.05)，且增殖作用具有时间效应(P0.05)。IGFI组和TNF组CK活性均低于对照组(P0.05),但随着时间延长IGFI组CK活性呈升高趋势。结论

2、IGFI促进C2C12骨骼成肌细胞的增殖，延迟其分化；TNF抑制C2C12骨骼成肌细胞的分化。 【关键词】 胰岛素样生长因子I 肿瘤坏死因子 恶病质在严重创伤、严重感染、癌症及艾滋病病人中常见。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)参与恶病质的发生、发展进程,是引起恶病质的主要细胞因子之一;具有抑制骨骼肌细胞蛋白合成,促进蛋白分解作用1。胰岛素样生长因子I(insulin like growth factorI,IGFI)能促进全身组织细胞的增殖和生长,并具有胰岛素样作用；能抑制细胞凋亡,维持细胞生存,还能保护一些细胞株免受由TNF诱导的凋亡,如胎儿脂肪细胞、大鼠成

3、骨细胞等25。笔者应用IGFI和TNF处理体外培养的小鼠C2C12骨骼成肌细胞,观察IGFI和TNF对C2C12骨骼成肌细胞增殖和分化的影响。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1细胞株C2C12小鼠骨骼成肌细胞株(中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)。 1.1.2试剂和仪器小鼠IGFI、小鼠TNF(英国PeproTech EC LTD);胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS (美国HyClone公司);高糖DMEM培养液(美国Gibco公司);噻唑蓝(MTT, 英国Biomol公司);二甲基亚砜DMSO(上海化学试剂一厂);肌酸激酶(CK)活性测试盒(南京建成生物工程研究所);752型紫外

4、分光光度计(上海分析仪器总厂);酶标仪(美国Biorad公司);相差倒置显微镜(日本Olympus公司)。 1.2方法 1.2.1细胞培养C2C12骨骼成肌细胞株置于含10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培养液,在37 、体积分数为0.05的CO2培养箱培养。采用对数生长期细胞进行实验。 1.2.2MTT法以浓度2.0104 mL1的细胞悬液接种96孔培养板中,每个实验组种9孔,每孔接种100 L,培养12 h细胞贴壁后,吸弃培养液,按实验分组加入相应培养液100 L继续培养。在24,48,72 h各个时相点的前4 h各取培养板1块,每孔加入浓度为5 mg/L MTT 50 L继续培养4 h

5、,吸弃上清液后向每孔加入20% DMSO 100 L,振荡后在酶标仪上以490 nm波长测光密度（D）值。 1.2.3CK活性测定以浓度5.0104 mL-1的细胞悬液接种6.25 cm4.0 cm的培养瓶,每瓶4 mL。培养12 h细胞贴壁后倒弃培养液,按实验分组加入相应培养液4 mL继续培养。在24,48,72 h各个时相点以0.25%胰蛋白酶消化收集各实验组细胞。用生理盐水(1 500 r/min,离心10 min)洗涤细胞2次,加双蒸水200 L,超声处理使细胞破碎,以3 000 r/min ,离心10 min后取上清夜。采用CK测试盒比色法测定D值,根据已知一定浓度标准品的D值计算C

6、K活性。 1.2.4实验分组对照组:含2%FBS的DMEM;I组:含2%FBS的DMEM+IGFI 100 ng/mL;T组:含2%FBS的DMEM+TNF 20 ng/mL;I+T组:含2%FBS的DMEM+TNF 20 ng/mL+IGFI 100 ng/mL。 1.2.6统计学处理数据以xs表示。采用SPSS 10.0统计软件进行方差分析。P0.05为差别有统计学意义。 2结果 2.1细胞增殖C2C12细胞在含2% FBS+100 ng/mL IGFI培养液培养72 h后光镜观察见图1。24,48,72 h检测IGFI和TNF对成肌细胞增殖影响的结果见表1。细胞核较大,细胞紧密相邻,有方

7、向性,细胞增殖活动旺盛,铺满培养瓶瓶底. 2.2细胞分化24,48,72 h检测各组CK活性见表2。 3讨论 IGFI是一类广泛存在于机体多种组织中的蛋白多肽,主要由肝脏合成,在体内受生长激素的调节。它能促进全身组织细胞的增殖和生长,增加细胞生长速度,并具有胰岛素样作用。IGFI促进细胞的增殖与其具有潜在的有丝分裂原功能有关。增殖的细胞必须进入细胞周期,IGFI促进细胞增殖作用通过促进细胞从G1期向S期转变6。本实验证实IGFI可促进C2C12成肌细胞的增殖。 低血清DMEM培养基可以诱导成肌细胞退出细胞增殖循环周期,促进其分化 7。本实验提示,用含2%FBS培养液低血清DMEM培养基可以诱导

8、C2C12骨骼成肌细胞的分化。通过与低血清的对照组比较,IGFI并无促进C2C12成肌细胞分化的作用。但随着干预时间的延长,CK值逐渐增高(P0.05),提示IGFI可延迟C2C12细胞的分化。成肌细胞分化时要离开细胞的增殖周期8,因此认表1不同时相点各实验组测定的吸光度n=9.I组:含2%FBS的DMEM +胰岛素样生长因子I 100 ng /mL;T组:含2%FBS的DMEM+肿瘤坏死因子 20 ng/mL;I+T组:含2%FBS的DMEM +肿瘤坏死因子 20 ng/mL+胰岛素样生长因子I 100 ng/mL.与对照组比较,:P0.05;与组内48 h比较,#:P0.05.表2不同时相

9、点各实验组测定肌酸激酶值n=4.I组:含2%FBS的DMEM +胰岛素样生长因子I 100 ng/mL;T组:含2%FBS的DMEM+肿瘤坏死因子 20 ng/mL;I+T组:含2%FBS的DMEM +肿瘤坏死因子 20 ng/mL+胰岛素样生长因子I 100 ng/mL.对照组比较,:P0.05;与组内48 h比较,#:P0.05;组间比较,:P0.05. 为IGFI促进C2C12成肌细胞增殖时,使细胞进入分裂周期,从而抑制了成肌细胞的分化。进入分化的成肌细胞是不可逆的,最终可导致肌管的形成。成肌细胞的增殖和分化与骨骼肌的发育和修复关系密切。 TNF是一种由多种免疫细胞、肿瘤细胞等分泌的细胞

10、因子,它在参与各种免疫应答、抗肿瘤、引起恶病质及内毒素性休克等病理生理过程中发挥重要作用。本实验中,TNF组及IGFI+TNF组的CK值均较同一时相点的对照组低(P0.05),提示TNF抑制C2C12成肌细胞的分化,且这种分化抑制未能被IGFI所拮抗。Guttridge等研究证明TNF在INF协调作用下,通过抑制核转录因子B(NFB),进而抑制骨骼肌细胞肌浆蛋白bHLH转录因子家族的 MyoD蛋白质转录,抑制骨骼肌分化,导致肌肉消耗,当采用NFB的拮抗物IBSR后MyoD被恢复9。 有研究表明,IGFI对受TNF伤害的C2细胞有微弱的改善蛋白代谢作用,其作用结果可能与影响细胞的分化和细胞凋亡有

11、关1。本实验通过IGFI和TNF对体外培养的C2C12成肌细胞在增殖、分化方面的影响，发现TNF抑制C2C12成肌细胞的分化未能被IGFI所拮抗,且IGFI对C2C12细胞的分化有延迟的作用，笔者认为IGFI改善TNF对C2细胞的蛋白代谢作用可能与其影响细胞凋亡方面关系更为密切，其作用机制仍需进一步实验研究。【参考文献】 1陈思曾,林永堃,吕新生. IGF对TNF伤害的鼠骨骼肌C2细胞蛋白代谢的影响J. 福建医科大学学报, 2003,37(4):361363.2王敏,黄象艳,李霞,等. 胰岛素样生长因子对臂丛神经损伤后骨骼肌细胞凋亡的影响J. 中国矫形外科杂志, 2003,11(19):137

12、11373.3李银平,黎檀实. 胰岛素样生长因子对海水浸泡大鼠肺泡上皮细胞的抗凋亡作用J. 中华急诊医学杂志, 2004,13(4):248250.4Ye P,DErcole A J. Insulinlike growth factorI protects oligodendrocytes from tumor necrosis factoralphainduced injuryJ. Endocrinology, 1999,140:30633072.5徐萍,张克勤,刘超,等. 重组人胰岛素样生长因子对大鼠成骨细胞增殖、凋亡及型胶原蛋白合成的影响J. 中国骨质疏松杂志, 2006,12(1):1

13、721.6李小川,吕刚,金明熙,等. 胰岛素样生长因子抑制人椎间盘细胞凋亡及促进基质代谢的研究J. 中华实验外科杂志, 2004,21(7):880.7秦瑞峰,顾晓明,黄富国. 流式细胞术测定骨骼肌细胞分化中DNA合成及其细胞周期变化J. 第四军医大学学报, 2000,21(8):921923.8秦瑞峰,顾晓明,张洁. 不同培养条件对骨骼肌细胞增殖及分化的影响J. 实用口腔医学杂志, 2000,16(1):1416.9Guttridge D C,Mayo M W. NF Binduced loss of MyoD mRNA possible role in muscle decay and cachexiaJ. J Sci, 2000,289:23632366.