临床医学论文-胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1在活化肝星状细胞中的表达及意义.doc

1、 临床论文-胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1在活化的肝星状细胞中的表达及意义作者:张郭晓红赵佳慧韩摘要目的研究转化生长因子 1 (TGF1)诱导的肝星状细胞中胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(IGFBPRP1)的表达以及抗igfbprp 1抗体对TGF1诱导的肝星状细胞中型胶原生成的影响。 方法体外培养大鼠肝星状细胞系(HSCT 6)，分为空白对照组(加入等量PBS)、不同浓度TGF1处理组和不同浓度抗IGFBPRP1抗体处理组。治疗因素作用24小时。免疫组织化学染色和Western blot检测IGFBPRP1在HSCT 6中的表达，ELISA检测型胶原的含量，并分析IGFBPRP1与型

2、胶原的相关性。 结果TGF1治疗组IGF BP rP1的表达明显高于空白对照组。 抗IGF BP rP1抗体能拮抗TGF1诱导的HSCT 6产生的过量型胶原。 IGF BP rP1与型胶原呈正相关(r=0.833，P 结论IGF BP rP1参与了肝纤维化的形成，可能在肝纤维化的发生发展中起重要作用。 【关键词】胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1；肝星状细胞；转化因子1；型胶原摘要目的研究胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1 (igfbprp1)在转化生长因子1诱导的肝星状细胞中的表达以及抗igfbprp1抗体对转化生长因子1诱导的肝星状细胞产生型胶原的影响。方法体外培养大鼠肝星状细胞系(HSC

3、-T6 ),然后与磷酸盐缓冲液(空白对照组)、2 g/L或4 g/L的TGF1(TGF1组)、0.1 g/L、1 g/L或2 g/L的抗IGF BP-rP1抗体(抗IGF BP-rP1抗体组)或两者(TGF1+抗IGF BP-rP1抗体组)共同孵育。24h后，免疫组织化学染色和western blotting检测HSC-T6中IGF BP-rP1的表达；ELISA法测定HSC-T6培养上清液中型胶原的含量；分析IGF BP rP1与型胶原的关系。结果TGF1组IGF BP rP1的表达明显高于空白对照组。ELISA结果显示抗IGF BP-rP1抗体拮抗TGF1诱导的HSC-T6过度产生型胶原。

4、IGF BP rP1与型胶原呈正相关(r=0.833，P 胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(IGF BP rP1)，即IGFBP7(也称为mac25)，是一种生物活性蛋白2 本实验旨在进一步阐明IGF BP rP1在肝硬化和肝纤维化发生发展中的作用，为寻找肝硬化和肝纤维化新的治疗靶点提供理论依据。 材料和方法1.1细胞和主要试剂大鼠肝星状细胞(HSC)品系(HSCT 6号)由美国Friedman S.L .教授提供；Tron storming生长因子 1 (TGF 1)是英国Peprotech公司的产品。免疫组化染色和Western blot检测IGF BP rP1羊抗人多克隆抗体，West

5、ern blot检测驴抗羊二抗，内参 actin均为美国Santa Cruz公司产品。免疫组化染色使用的抗山羊二抗由免疫组化试剂盒(SP法)提供，抗山羊二抗和二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒均购自福建迈信生物科技发展有限公司；牛血清白蛋白(BSA)是美国罗氏公司的产品。分子量标记是立陶宛MBI公司的产品；PVDF膜是美国SABC公司的产品；细胞质核蛋白提取试剂盒购自北京普利莱科技有限公司；型胶原蛋白ELISA定量检测试剂盒为北京博森生物技术有限公司产品 1.2处理因子分组并加入和丢弃旧的HSCT 6培养基，然后换成含0.3%胎牛血清的培养基进行培养，加入处理因子进行实验分组。 分为空白对照组(

6、加入等量PBS)和TGF 12，4，8，16 g/L组。将细胞处理24小时(预实验为6、12、24、36和48小时，其中IGF BP rP1的表达在24小时变化最显著)，然后收集细胞玻片。处理重复一次，提取细胞质蛋白，然后通过免疫组织化学染色和蛋白质印迹分析。空白对照组、TGF1 2、4 g/L组、抗IGFBPRP1抗体0.1、1、2 g/L组和TGF1 2 g/L+抗IGFBPRP1抗体0.1 g/L、TGF1 2 g/L+抗IGFBPRP1抗体1 g/L、TGF1 2 g/L+抗IGFBPRP1抗体1。TGF1 4 g/L+ 0.1 g/L抗IGFBPRP1抗体，HSCT 624小时后收集

7、细胞培养液上清液进行ELISA检测。 1.3免疫组织化学染色检测HSC-T6中igfbprp1表达细胞。载玻片用1%多聚甲醛固定5分钟，用内源性过氧化物酶阻断剂孵育以灭活内源性过氧化物酶，用PBS洗涤，用正常非免疫动物血清密封，然后用igfbprp1抗体(1200)孵育过夜，用PBS洗涤，用生物素标记的抗山羊IgG抗体孵育，用PBS洗涤，用过氧化物酶标记的链霉素亲和素孵育。 用PBS代替IGF BP rP1抗体(一抗)作为空白对照染色。 图像分析系统对图像进行半定量分析，从每个切片中随机选取5个视野(200)，测量细胞内棕色和棕色阳性表达颗粒的累积光密度(IOD)值。 每个实验重复6次。 1.

8、4 IGF BP-rP1表达的蛋白质印迹分析去除培养物上清液，用PBS洗涤一次，用0.25%胰蛋白酶消化HSCT 6，收集所有细胞，离心，并在离心后将500 l细胞质裂解物加入100 l细胞沉淀物中以裂解蛋白质。 取30 l总蛋白含量裂解液进行15%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳。 通过PVDF膜转移 5%牛血清白蛋白TBST溶液(TBS+0.1% Tween20)密封3小时，与IGF BP-rP1抗体(1500)孵育过夜，洗涤，然后用与辣根过氧化物酶偶联的第二抗体处理3小时。洗涤后，DAB显色。 用同样的Western印迹膜洗涤后，孵育并与肌动蛋白杂交作为内参。 计算机

9、扫描分析，测量灰度值(A)，得到内参肌动蛋白校正后的蛋白质相对表达量。 每个实验对3批以上的不同样品重复进行。 1.5 ELISA法检测HSCT 6培养基上清液中型胶原的含量。收集细胞培养基上清液作为待测样品，检测步骤按照试剂盒说明书进行。 每个实验重复6次。 1.6统计分析所有数据均以S表示，用SPSS 11.5统计软件进行单因素方差分析，组间差异用SNK q检验，相关性用Pearson相关分析。 P 结果2.1 IGFBPRP1在HSCT 6中的表达各组细胞中，胞质内可见棕褐色或棕褐色颗粒，igfbprp 1呈阳性表达，但程度不同。 空白染色的细胞数量少，颜色浅，而TGF1处理组的大多数细

10、胞胞质为褐色甚至褐色。TGF1 4 g/L组阳性细胞最多，染色最深，如图1所示。 蛋白质印迹分析如图2所示。 igfbprp 1的iod值和a值在空白对照组中较低，与空白对照组相比，实验组升高，并在TGF1 2和4 g/L组中呈剂量依赖关系，但TGF1超过4g/L IGF BP rP1而降低(表1) 2.2 IGFBPRP1与HSCT型胶原的相关性分析6线性相关回归分析显示igfbprp 1与型胶原呈正相关(r = 0.833，P 型胶原的ELISA结果见表2。 表1 igfbprp 1的累积光密度和灰度值表2型胶原的ELISA检测结果3近年来的讨论发现，虽然肝纤维化的发病机制不同，但肝纤维化

11、的共同特点是活化的HSC产生过多的细胞外基质沉积在肝脏上形成肝纤维化3 HSC是肝纤维化的重要效应物，也是细胞因子的主要来源和靶点4 TGF1是激活HSC并促进其表达细胞外基质的关键因子。当TGF1与相应的特异性受体结合时，可以激活HSC，促进其增殖和胶原分泌。 TGF1与肝纤维化程度关系最密切，是肝纤维化的主要细胞因子5 Boers等6的研究表明，活化的HSC可能是肝脏IGF BP rP1的主要来源细胞。还发现，在肝纤维化过程中激活的HSC向肌成纤维细胞转化的过程中，IGF BP rP1基因在转化中期高度表达。 因此，推测IGF BP rP1可能是HSC活化的特异性标志，并可能成为肝纤维化的

12、新标志。 我们前期的研究发现，肝纤维化患者肝组织中igfbprp1的表达明显高于空白对照组，并且随着病情的加重，igfbprp1的表达逐渐增加。 图像分析结果显示各组间有显著差异。 IGF BP rP1的表达部位主要位于肝窦和纤维间隔中纤维间隔周围的HSC、成纤维细胞和肝细胞中。并与肝组织中TGF1、TGFRI和胶原纤维的表达呈正相关7 为了检验这个假设，我们在体外培养了HSCT 6号。经不同剂量TGF1处理后，免疫组织化学染色和Western blot分析显示，空白对照组IGFBPRP1表达较低。但不同剂量TGF1的HSCT 6中IGFBPRP1的表达水平明显高于对照组，在一定范围内呈剂量依

13、赖性关系，其中TGF1 4 g/L组的作用最强。 说明IGF BP rP1在TGF1诱导的肝星状细胞活化中可以过表达。 而高浓度TGF1 ( 4 g/L)组IGFBPRP1表达下降，可能是因为随着HSCT 6的持续激活，HSC自分泌TGF1逐渐增加，外源性TGF1刺激的IGFBPRP1生长速率下降，完全激活的HSCT 6内源性TGF1较高，对外源性TGF1的反应性下降。 这也说明HSC和TGF1在肝纤维化过程中相互制约、相互促进。 HSC是细胞外基质的重要来源8 TGF1刺激活化HSC最明显的靶效应是诱导HSC合成大量型胶原等。阻断HSC中TGF1的信号转导通路可以抑制这种靶效应。 我们选择在

14、HSCT 6培养物的上清液中检测到的I型胶原的量作为胶原分泌的表达。观察到正常培养(活化)的HSCT 6号虽然I型胶原分泌背景值较高，但TGF1仍能促进HSCT 6号分泌I型胶原，明显高于未经TGF1处理的HSCT 6号。 同时，我们分析了TGF1处理后IGFBPRP1表达增加与型胶原分泌增加的相关性，表明IGFBPRP1的高表达与型胶原分泌增加呈正相关。 抗IGFBPRP1抗体显著抑制TGF1刺激的HSCT 6分泌型胶原，其中1 g/L的抗IGFBPRP1抗体作用于TGF1 4 g/L最为显著。 这表明抗IGF BP rP1抗体能拮抗TGF1诱导的肝星状细胞I型胶原过度表达，并能拮抗TGF1

15、对肝纤维化的影响。另一方面，也表明IGF BP rP1可能在肝纤维化的形成中起着非常重要的作用。 【参考文献】【1】永利塔。常见和独特的机制调节不同纤维疾病的纤维化。临床投资杂志，2007年，第117卷第3期，第524-529页。2阮伟，徐峰，等. IGFBP7在大肠癌发生中起着潜在的抑癌基因作用.癌症生物学，2007，6(3):354-359。3帕森斯CJ，高岛M，里佩RA。肝纤维化形成的分子机制。中华胃肠病学杂志，2007，22增刊1:S79-84。4基塞利瓦T布伦纳达。星状细胞与纤维化逆转。中华胃肠病学杂志，2006，21卷3期:S84-87。5 Wolf E，Schneider MR，Zhou R，等. IGFBP过量对转基因小鼠的功能影响.儿科肾脏学，2005，20(3):269-278。6 Boers W，Aarrass S，Linthorst C，等.转录谱揭示了肝纤维化形成的新标记。生物化学杂志，2006，21 (24): 16289-16295。7田晓霞，秦桂秀，齐克明，等.胰岛素样生长因子结合蛋白在肝纤维化患者肝组织中的表达及意义.中国肝病杂志，2006，14 (11): 858-860。8等.基质作为肝纤维化形成的调节剂。塞明肝脏疾病杂志，2001，21(3):351-372。