临床医学论文-脂肪源干细胞修复兔膝关节全层软骨缺损研究.doc

临床论文——脂肪干细胞修复兔膝关节全层软骨缺损的研究【摘要】在兔膝关节髌股关节面中央人工制造全层关节软骨缺损后，观察和评价脂肪干细胞和藻酸钙凝胶移植到软骨缺损内的效果，探索一种简单有效的修复关节软骨缺损的方法。 [方法]将27只新西兰大白兔随机分为A、B、c三组，A组用藻酸钙凝胶修复关节软骨缺损，B组不做任何处理。C组用未诱导的脂肪干细胞复合藻酸钙凝胶修复缺损。分别于术后4、8、12周处死动物。通过肉眼观察、组织切片观察、透射电镜等技术手段观察修复效果。修复采用改良Wakitani评分标准。 [结果]A、B组软骨缺损被纤维组织填充，组织学切片可见纤维组织覆盖；C组软骨缺损被透明软骨样组织填充；组织切片中可见软骨样细胞及其周围的腔隙；电镜下，细胞周围可见大量胶原纤维；C组与A组和B组比较，差异有统计学意义(P [结论]单纯脂肪干细胞复合藻酸钙凝胶能有效修复关节软骨全层缺损。 【关键词】脂肪源性干细胞藻酸钙软骨摘要:[目的]在股骨髌面中心人工制作模型后，评价非诱导脂肪源性干细胞(ADSCs)与藻酸钙修复兔膝关节全层软骨缺损的效果，寻找一种简单易行的关节软骨缺损修复方法。[方法]将27只新西兰大白兔随机分为A、B、C组。A组兔软骨缺损处植入藻酸钙，B组兔软骨缺损处不植入藻酸钙，c组兔软骨缺损处不植入藻酸钙。用肉眼、组织切片和透射电镜评价修复组织，根据改良Wakitani分级标准评分。总分用统计软件SPSS 11.5进行分析。[结果]组织切片和显微镜下观察，A组和B组动物关节软骨缺损被含有原纤维的纤维组织所填充。缺损用软骨细胞样组织填充。组织切片可见软骨细胞样细胞，周围有腔隙。透射电镜下可见细胞周围有大量胶原纤维。C组与A、B组相比有显著性差异(P 随着干细胞培养技术和组织工程技术的不断进步，多种组织工程方法被应用于探索软骨缺损治疗的可行性。 2001年，祖克·帕和朱敏[1]首次从人类脂肪组织悬液中分离获得了多能干细胞。 目前，已经证明脂肪源性干细胞(ADSCs)可以分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌肉细胞和心肌细胞[2] 本实验采用纯脂肪干细胞复合藻酸钙凝胶载体修复兔膝关节全层软骨缺损，并对实验结果进行观察和分析，探讨应用纯脂肪干细胞修复关节软骨缺损的可行性，探索一种简单有效的修复关节软骨缺损的方法。 材料和方法1.1实验材料1.1.1主要仪器(1)洁净工作台(JHT-DDC型，济南康宝净化设备有限公司)；(2)恒温培养箱(德国Heraeus公司)；(3)倒置相差显微镜(日本尼康te 2000)；(4)50毫升培养瓶(美国康宁公司)；(5)低温高速离心机(德国Heraeus公司) 1.1.2主要试剂(1)DMEM培养基(美国Gibco公司)；(2)I型胶原酶(美国适马公司)；(3)胰蛋白酶(中国上海华美公司)；(4)胎牛血清(天津昊阳生物制品科技有限公司)；(5)D-汉克氏平衡盐(美国适马公司)；(6)海藻酸钠(上海化学试剂站包装厂)；(7)氯化钙(上海龚升生物工程有限公司) 实验方法2.1脂肪干细胞的获取、培养和鉴定取新西兰大白兔，无菌取双侧髂窝脂肪组织约10 ml，用2倍体积的D-Hank氏平衡盐溶液冲洗3次，切成1 mm1 mm1 mm 1mm大小，加入0.2% I型胶原酶5 ml，于37℃培养箱中消化0.5 h，于高速离心机中以1 000 r/min离心10 min，弃去上清液， 加入160 mmol/L NH4Cl约5 ml溶解红细胞10 min，用筛网过滤，以8 000个细胞/cm2接种于50 ml培养瓶中。 将烧瓶置于37℃下体积分数为5%的CO2培养箱中。 24小时后第一次换液，去除残余红细胞和非贴壁细胞，以后每2 ~ 3天换液一次。当融合率达到80%以上时，动物实验用细胞传至第四代。 部分第二代细胞在含10%胎牛血清、0.1 μmol/L地塞米松、50 μmol/L维生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的DMEM诱导培养基中诱导为成骨细胞。 2.2动物实验:健康成年新西兰白兔27只(购自山东鲁抗实验动物中心)，体重2.5~3.5 kg，雌雄不限。 编号后，随机分为A、B、C组，每组9只。实验中使用了两个膝盖。 10%水合氯醛用于耳缘静脉麻醉。取双侧膝关节内侧切口，将髌骨向外侧推入关节腔。 左右两侧用直径3.5 mm的钻头在髌股关节面中央造成全层关节软骨缺损，深度约2.5 mm，直至点状出血。 A组:(18膝)单纯在缺损处植入藻酸钙凝胶。 B组:(18膝)，空白对照组，不处理缺损。 c组:(18膝)，放置培养的脂肪干细胞/海藻酸钙凝胶复合物，最终细胞浓度不低于2.0106个/ml。 兔子清醒后，放在笼子里自由活动。青霉素肌肉注射5天。 2.3检测方法2.3.1细胞学检测的生物学特性观察:观察细胞生长情况；部分第二代细胞制成细胞玻片，油红O染色；此外，将部分向成骨细胞诱导的第二代细胞制成细胞爬片，用Von Kossa染色观察矿化结节，以确认培养的细胞是否具有干细胞特征。 2.3.2修复组织检测:术后4、8、12周处死动物，取材进行大体、光镜和电镜观察。 (1)大体观察:膝关节滑膜有无充血、水肿，关节囊有无粘连，修复组织的平整度、光泽度；(2)组织学检查:脱钙、梯度酒精脱水、常规石蜡包埋、切片、HE染色、甲苯胺蓝染色，光镜下进行组织学观察；(3)透射电镜观察:将12周大的修复组织包埋，然后切成超薄切片，观察细胞和基质。 2.4统计分析根据改良的Wakitani评分标准(见表1)，通过盲法对所有标本进行组织学评分。 每个标本由3人评分，取平均值。得分用SPSS 11.5统计软件进行分析，并与对照组进行Dunnett检验。 表1软骨缺损修复的组织学评分标准指数组织学表现评分3结果3.1培养诱导的脂肪来源干细胞接种后24小时左右开始贴壁，细胞形态为长梭形、三角形或多边形(图1)。 细胞生长旺盛，3 ~ 4天即可传代。 将部分第2代细胞制成细胞玻片进行油红O染色，苏木精对细胞核再次染色，细胞质不被油红O染色(图2)。可见细胞质中没有脂质，与脂肪谱系细胞没有相关性。 细胞经过7代培养后仍能旺盛增殖。 将向成骨细胞诱导的第2代细胞制成细胞玻片进行Von Kossa染色，观察到形成的矿化结节为黑色，有Ag+沉积(见图3)，表明培养的脂肪源干细胞具有分化为成骨细胞的能力、潜在分化特性和干细胞特性。 3.2一般术后3 ~ 4天动物轻度跛行，一周左右恢复正常。 膝关节无红肿热等炎症。 动物处死后关节液清澈，关节囊无挛缩、粘连及新的生物形成，滑膜无充血水肿，软骨无糜烂，关节边缘无骨赘形成。 术后4周，A组和B组缺损修复组织基本相同，缺损未完全填充，修复组织灰白色，基底部分深红色，未见明显炎性肉芽组织。C组缺损未完全填充，但修复组织外观黄白色，表面粗糙。它是一个连续的小丘，与周围的关节软骨有清晰的边界。 术后8周，A组和B组缺损的修复组织仍基本相同，缺损未完全填充，但比以前多，修复组织仍呈灰色、粗糙，C组缺损未完全填充，修复组织也比以前多，表面黄白色，光滑有弹性，仍可辨认与周围正常软骨的边界。 术后12周，A组和B组大部分缺损完全填充，基本被纤维组织覆盖，表面与正常软骨齐平，深灰色，柔软，与周围正常软骨组织分界清楚，易于剥离。C组缺损区修复组织的颜色和质地与正常关节软骨相同，表面光滑，与周围软骨组织界面齐平并完全整合，结合紧密，不易剥离，与周围正常软骨组织界限模糊(图4)。 3.3组织学观察:术后4周，A、B组缺损区凹陷，布满血块和纤维组织，甲苯胺蓝染色显示无染色纤维组织；C组见少量类似未成熟软骨细胞的增殖细胞，基质较少，细胞排列稍紊乱不规则，细胞形态较小，周围无典型的腔隙样结构，甲苯胺蓝染色无明显异染，无明显多核炎性细胞。 术后第8周，组织学与第4周相似。A组和B组缺损区被纤维组织覆盖，有纤维形成，修复组织呈波纹状，修复组织不均匀、稀少。C组修复组织中有大量未成熟软骨细胞和基质，软骨样陷窝常见，细胞分布不均，甲苯胺蓝异染明显。 术后12周，A、B组修复组织多为粗大的原纤维，少数未完全填充，原纤维呈波纹状排列，未见软骨陷窝，甲苯胺蓝染色较少且不均匀。C组修复的软骨样组织与周围正常软骨基本连接。软骨样细胞在形状上与正常软骨细胞相似，但与正常软骨细胞相比，其排列是非柱状和不规则的。软骨样细胞周围有软骨样腔隙(见图5)，无炎性细胞浸润，甲苯胺蓝染色比以前更均匀。 3.4透射电镜观察在透射电镜下，可以看到海藻酸钙凝胶孔径大，交联紧密，壁厚。 A、B组4周时缺损内有较多红细胞，8、12周时缺损内充满纤维组织，多为层状纤维组织。海藻酸钙4周部分降解，8周部分降解。第8、12周，C组修复组织中可见未成熟的软骨细胞样细胞，细胞呈圆形或椭圆形，表面有不规则突起。胞质内可见丰富而扩张的粗面内质网和小而圆的线粒体，周围有较多的基质，周围基质中有纵横排列的细胶原纤维(图6)。 海藻酸钙4周部分降解，8周部分降解。 3.5统计软件分析结果与其他两组相比，脂肪干细胞/海藻酸钙凝胶复合移植组在不同时期的评分有显著性差异(P Dunnett检验显示，海藻酸钙凝胶移植组与空白对照组在各个时期均无显著性差异(P>0.01) (见表2)表2组织学评分时间4讨论关节软骨是一种高度分化的组织，自我修复后通常为纤维组织或纤维软骨组织，形成透明软骨组织的能力有限。 软骨移植可以形成透明软骨修复[3]，但缺点是软骨细胞本身是高分化细胞，体外增殖能力有限。自体移植的过程还会对受损的关节造成额外的损伤，需要进行二次手术，既麻烦又昂贵[4] 组织工程技术为修复软骨缺损带来了希望。 骨髓基质细胞的发现及其在软骨组织工程中的应用研究较早，但骨髓基质细胞的取材、培养、诱导和移植相对麻烦，经济和临床效果不理想。 在体外培养条件下，脂肪干细胞表现出与骨髓基质细胞相似的分化能力，并具有易得、快速扩增和多向分化潜能的特点。 在本实验中，培养的脂肪干细胞容易获得，培养和扩增效率高，具有分化潜能，是优良的种子细胞。 脂肪来源的干细胞在软骨培养基中体外培养时，可以被诱导成软骨系统，组织学和组织化学清楚地显示了软骨细胞的表型。 软骨分化过程中，特征分子如ⅱ型胶原、软骨寡聚蛋白和软骨蛋白聚糖表达，体外诱导和体内形成的软骨低水平表达X型胶原和I型胶原[5] 约12周后，C组修复组织为软骨样组织，透射电镜照片可见大量间质，并观察到类似的组织学结果。 德拉戈·JL等[6]将复合纤维凝胶诱导成软骨的脂肪干细胞移植到兔股骨髁全层软骨缺损处，结果显示修复效果满意。 本实验的主要目的是，由于无法判断诱导后植入后体内真实的生理环境是否会再次作用于被诱导的细胞，与其用人工方法诱导植入后的细胞，增加了过程的支出和复杂性，不如省略人工模拟诱导过程，将简单细胞直接植入关节软骨缺损内，在恢复过程中由真实的生理环境诱导分化，可能更接近真实的修复。 如果修复效果令人满意，将为软骨组织工程修复软骨缺损提供一种简便的方法。 在本实验中，脂肪来源的干细胞在植入前故意不诱导向软骨方向分化，只是在证明其具有干细胞的特性后，与海藻酸钙凝胶混合后直接植入缺损处，最终结果与德拉戈·JL等人的结果大体一致，表明植入后真实的生理环境诱导与人工诱导差别不大。 但由于两种实验方法在建模、评估方法等方面存在一些差异，这是否属实还需要后续的大规模动物对照实验进一步验证。 图1培养的脂肪干细胞24小时后贴壁，状态为长梭形、三角形或多边形。 相差显微镜200图2:培养的脂肪来源的干细胞被油红0染色，苏木精再次染色细胞核，细胞质未被油红0染色。 右上角是正控。 苏木精油红0染色200图3成骨细胞定向诱导的第2代细胞制成细胞玻片进行Von Kossa染色，形成的矿化结节呈黑色，有Ag+沉积。 Von Kossa染色100图4，术后12周，大体观察显示A、B组缺损大多完全填充，基本被纤维组织覆盖，而C组修复组织与正常关节软骨相似，其与周围正常软骨组织的边界模糊图5，术后12周，A、B组修复组织多为粗大的原纤维， 少数未完全填充，C组修复的软骨样组织基本与周围正常软骨相连，软骨样细胞形态与正常软骨细胞相似。 图中的箭头表示原始缺陷。 HE 200图6术后12周，C组修复组织中可见未成熟的软骨细胞样细胞，周围有较多基质，周围基质中有纵横排列的细小胶原纤维。 TEM 4 200海藻酸钠是从海藻中提取的线性多糖成分，类似于软骨基质中的蛋白聚糖[7] 藻酸盐可以与二价阳离子如钙离子交联，形成具有网格结构的多孔材料，通常是果冻状凝胶。藻酸盐作为一种可注射的支架材料，常用于组织缺损的填充和组织工程中的细胞载体。 海藻酸钙凝胶在体内水解为葡萄糖醛酸和甘露糖醛酸单体，无毒，有免疫原性，生物相容性好。 实验结果表明，脂肪干细胞在藻酸盐支架中诱导成软骨后，表现出与脂肪干细胞良好的相容性[8] 本实验中，海藻酸钙凝胶在6周左右完全降解，组织切片未见明显炎性细胞浸润。海藻酸钙植入后，约4 ~ 6周内大部分降解，表明其作为组织工程载体具有良好的应用前景。 同时，实验中还观察到C组动物的软骨缺损并非全部得到完全修复，其原因有待进一步探讨。 总之，脂肪组织在体内丰富，容易获得，有利于脂肪干细胞的收集，易于扩增，因此脂肪干细胞是一种非常有前途的软骨缺损修复相关的软骨组织工程种子细胞。 自脂肪干细胞被发现并被证明具有多向分化潜能以来，随着时间的发展和相关研究的深入，脂肪干细胞向软骨诱导的技术已经成熟，相关软骨组织工程体内外研究的实验结果令人满意[6，8]，为软骨缺损的治疗提供了新的途径。 但在现有文献记载的相关动物实验中，体内观察时间较短，远期修复效果有待进一步研究。 实验结果表明，脂肪干细胞联合海藻酸钙凝胶移植修复全层关节软骨缺损的近期效果也是理想的，是一种有前途的简单有效的修复关节软骨缺损的组织工程方法。 [参考文献] [2] Strebm，Hikkok 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